Alpha CETSA base de dados de Conhecimento

• CETSA®
• Alvo/Tipos de Amostra
• CETSA® Condições de Ensaio
• Alpha CETSA® Imunoensaios
• CETSA® Análise e Interpretação dos Dados

Disclaimer: apenas Para fins de investigação. CETSA® é uma marca registada da Pelago Bioscience AB. Por favor, note que é necessária uma assinatura CETSA® válida para uso em kit.

o próprio método CETSA®

Q: O que é CETSA®?

A : O ensaio de deslocamento térmico celular é um método que permite a quantificação do engajamento alvo de um composto (TE) dentro de células vivas ou em células perturbadas. O princípio do ensaio CETSA® baseia-se na Alteração do perfil de desnaturação térmica da proteína-alvo que ocorre após a ligação de um composto. O ensaio CETSA® é realizado incubando as células com o composto de ensaio, seguido de aquecimento das células tratadas com o composto e, em seguida, medindo a restante proteína-alvo solúvel.

Q : O Que é o deslocamento térmico

a: Ao aquecer uma proteína irá encontrar uma temperatura a que ela se desnatura (por vezes referido como o ponto de fusão). Esta temperatura de fusão é uma propriedade física e uma constante para qualquer conjunto de condições (pH, pressão, sais). Compostos que interagem com uma proteína irão mudar a temperatura de fusão (deslocamento térmico). Para um determinado local de ligação dentro de uma proteína, o tamanho do deslocamento térmico pode ser medido em diferentes concentrações de compostos (dose-resposta), e os valores CE50 derivados dessas curvas podem ser usados para estabelecer uma ordem de potência de uma série de compostos, que se correlaciona diretamente com a ordem de afinidade dos compostos . Existem várias variações no ensaio de mudança térmica in vitro, mas a técnica chave foi descrita pela primeira vez por Semisotnov et al. (1991). Neste método, a proteína de fusão e desdobramento expõe superfícies hidrofóbicas que permitem a ligação da laranja SYPRO. A fluorescência deste corante é extinta em água, de modo que a ligação a estas superfícies hidrofóbicas reverte isso e faz com que a fluorescência atinja o pico quando a proteína é totalmente desdobrada. Este tipo de ensaio de mudança térmica só pode ser aplicado a proteínas altamente purificadas e, para espécies de baixa abundância, isto pode significar que é necessário um sistema de sobre-expressão para gerar quantidades suficientes.

Termofluor – temperature sensitive dye system(using Sypro Orange)

Differential scanning fluorimetry – DSF) – alternative dye based methods

Quantitive PCR systems (eg Roche Light cycler) : estes são utilizados para produzir o evento de aquecimento e podem medir as alterações de fluorescência

Nanotemper-é um instrumento específico de fabrico da empresa que aquece a amostra e mede a fluorescência. Oferece melhor desempenho do que os sistemas de PCR adaptados.

Q: Por que é importante medir o envolvimento no alvo?

A: na ausência de confirmação de que um composto realmente interage com o alvo desejado, os desenvolvedores de drogas podem perder tempo precioso e recursos movendo-se na direção errada. Por essa razão, a confirmação do envolvimento alvo de um composto tem sido considerada essencial na descoberta de drogas. Tais ensaios permitem comparações diretas da afinidade de um composto para o seu alvo a ser feito, como tal é uma medida essencial para selecionar quais compostos para avançar em todas as fases de geração e otimização de chumbo. Uma vez que o engajamento alvo pode ser correlacionado com a afinidade, permite que os pesquisadores selecionem compostos que tenham os maiores valores de afinidade. Como tal, é uma medida extremamente útil para garantir a correta priorização de compostos em cada fase do processo de descoberta de drogas.

Q: Como É que o CETSA® difere de outras tecnologias de ensaio de mudança térmica?

A: ao lado de CETSA ®, existem numerosos métodos para avaliar o engajamento alvo (por exemplo, ressonância de Plasmões de superfície, polarização de fluorescência e deslocamento térmico). No entanto, todos estes métodos dependem da disponibilidade de proteínas purificadas e só podem ser aplicadas in vitro, o que significa que os valores de afinidade derivados podem não ser preditivos da afinidade real ou do potencial de ligação nas células vivas. Ser capaz de executar Térmica Mudança de ensaios em um relevantes celulares contexto, onde a proteína é em seu ambiente nativo, na presença de seu parceiro natural de proteínas, com a concentração fisiológica de seus cofatores e substratos, rende muito mais dados relevantes, que melhor traduzem em modelos animais e estudos clínicos.

Enquanto o Celular Térmica Shift Assay é um método que se baseia no mesmo princípio biofísico como padrão Térmico shift ensaios (i.e. que proteínas específicas que irá desnaturar em um conjunto de temperatura) não medir diretamente a temperatura específica de desdobramento, mas confia em vez disso, o fato de que a presença de um composto sobre a proteína vai afetar a quantidade de proteína solúvel presente após aquecimento a uma temperatura definida. Como tal, o CETSA® é essencialmente um ensaio de proteína total realizado após um evento de aquecimento específico. Compostos com diferentes potências de engajamento alvo irão mudar as quantidades relativas de proteínas sobrevivendo ao evento de aquecimento. Uma vez que o ensaio mede esta proteína residual, e não o evento de fusão real, ela pode ser aplicada a Sistemas in vivo mais complexos, como células e lisatos (e em alguns formatos CETSA® até mesmo tecido sólido). Além disso, CETSA® pode identificar compostos que desestabilizam uma proteína (ou seja, reduzir a sua temperatura de fusão), isto é menos direto para a frente com os outros métodos de deslocamento térmico.

Q: Como É Que o Alpha CETSA® difere de outras tecnologias de ensaio de mudança térmica celular ou de outros ensaios de engajamento de alvos celulares?

A: como mencionado acima, CETSA® é basicamente um doseamento de proteína total realizado após choque térmico. Alpha CETSA® utiliza um sistema de detecção de proximidade de anticorpos duplo. Outros métodos evitam a utilização de um sistema baseado em anticorpos modificando a proteína alvo.:

• Promega nanoluciferase ensaio de mudança térmica (NaLTSA): Nanoluc Luciferase fundida à proteína-alvo (proteína recombinantemente expressa); Quando o alvo proteico com a enzima Nanoluc se agrega, o sinal de luciferase irá diminuir.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay: Luciferase Fusion Tag combinada com compostos traçadores rotulados que, na proximidade imediata da luciferase, conduzirão à transferência de energia de ressonância por bioluminescência (BRET). A ligação composta no mesmo bolso irá deslocar o tracer e o sinal BRET irá diminuir. Isto não é um método de choque térmico.
• DiscoverX InCELL Pulse: Based on Enzyme Fragment Complementation (EFC) technology : a proteína-alvo é fundida com um pequeno fragmento dador enzimático de β-galactosidase (β-gal). Uma proteína repórter adicionada ligar-se-á a este fragmento para reconstituir uma enzima activa, que hidrolisará um substrato e gerará um sinal quimioluminescente, permitindo a quantificação da abundância de proteínas. Após a desnaturação do calor, a proteína agregar-se-á e limitará o acesso do componente maior da luciferase ao seu parceiro no alvo proteico.

a principal diferença entre estes sistemas ” recombinante CETSA® “ou” compromisso alvo recombinante ” e Alfa CETSA®, é que não podem ser aplicados a células nativas e não modificadas. Isto tem uma série de consequências negativas.:

1. Enquanto o custo de desenvolvimento de um romance de anticorpos par e a subsequente por bem os custos podem ser mais altos do que simplesmente transfecting uma única célula da linha, é provável que qualquer programa de descoberta vai querer ser testado com uma variedade de modelo de células, linhas, cada transfection vem com seus próprios custos e clonagem as próximas linhas celulares vai demorar semanas adicionais.
2. gerar uma proteína marcada terá sempre consequências fisiológicas sobre a célula e a proteína marcada pode ser (i) sobreexpressada (estequiometria errada vs. parceiros), (ii) não localizados no compartimento celular correcto ou (iii) não associados a proteínas chave parceiras e (iv) podem ter um comportamento de fusão diferente do da proteína nativa. O que significa que o efeito aparente de um composto pode não reflectir o seu comportamento real no tecido do paciente. Estes problemas podem ser ampliados em qualquer sistema de transfecção temporária.Os inibidores da Luciferase podem resultar em resultados falsos positivos.
3. em fases posteriores de otimização do chumbo, quando são necessários modelos celulares mais complexos e fisiologicamente mais relevantes (primários, linhas celulares nativas e tecidos), abordagens de proteínas marcadas simplesmente não são aplicáveis.

Q: Que informação fornece um doseamento CETSA®?

A: CETSA® fornece uma medida única de um composto “na presença-alvo” e pode ser considerado como ocupação-alvo. Esta ocupação será afetada tanto pela capacidade dos compostos de engajar o alvo e a capacidade do composto de estar presente no local certo (i.e. tem a solubilidade, a permeabilidade certas, a estabilidade metabólica e a disponibilidade no compartimento celular direito). Os testes de engajamento de alvos não-celulares oferecem medidas de afinidade que se correlacionam apenas com o comportamento da proteína em ambientes altamente artificiais, muitas vezes usando proteínas alvo purificadas e recombinantemente expressas.

Q: Pode o CETSA® ser utilizado em estudos de análise SAR?

A: ainda não existem exemplos publicados onde CETSA® foi usado para otimização de compostos. No entanto, o potencial e a aplicabilidade do CETSA® a ser utilizado para a análise SAR e confirmação hit foram claramente demonstrados por Shaw et al. pela comparação dos dados do ensaio CETSA® com os dados do ensaio bioquímico e celular habitualmente utilizados (Shaw et al. 2018 SLAs Discovery 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). A publicação demonstra o valor acrescentado do CETSA® para rastreio, confirmação de resposta positiva e geração de RAE para dois alvos proteicos: B-Raf e PARP1.

tipos de alvo / amostra

Q: quantos alvos foram validados em CETSA® até agora?

A: Em CETSA® HT (sendo a maioria Alfa CETSA®, alguns usando HTRF) mais de 30 alvos foram validados com sucesso, incluindo alvos com localização nuclear, mitocondrial, citoplasmática e membrana plasmática.

mais de 100 alvos foram validados até agora no CETSA® Classic (Western Blot based detection).

CETSA® M / S está a gerar informação para 6000 a 7000 alvos de uma só vez.

Q: Todas as proteínas-alvo podem ser testadas em CETSA®?

R: alguns alvos são “cegos” em CETSA®, i.e. a ligação composta não mudará a estabilidade térmica. Isso pode acontecer quando a proteína tem vários domínios, e o composto é vinculado a um único domínio, e se a estabilização deste único domínio não está afetando globalmente a estabilidade térmica de toda a proteína. Existem algumas proteínas que não derretem em temperaturas típicas aplicadas em experimentos com CETSA®.Pelago tem acesso a uma grande base de dados com dados de estabilidade térmica de projetos com leitura espectrométrica de massa (CETSA® MS), e esta informação é tida em conta quando Pelago está avaliando a “viabilidade CETSA®” de um alvo proteico antes de desenvolver um teste Alpha CETSA®. Por favor, contate Pelago para solicitar tais informações.

Q: As GPCRs são acessíveis à CETSA® ?

A: alguns exemplos de GPCRs foram testados em CETSA® . Em uma publicação recente da Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019) os ensaios clássicos CETSA® foram estabelecidos para um conjunto de proteínas ligadas à membrana, incluindo um alvo de proteína GPCR. Um potencial desafio com CETSA® em GPCRs pode ser a disponibilidade limitada de anticorpos para detecção. Além disso, a localização integral da membrana do GPRCs pode levar a um comportamento de fusão imprevisível.

Q: Que tipo de amostras pode ser testado em CETSA®?

A : Existem exemplos de ensaios com CETSA® utilizando vários tipos diferentes de matrizes, incluindo linhas celulares imortalizadas, células primárias, células IP, células PBMCs derivadas de doentes, esferóides, frações nucleares de células cultivadas, tecidos tratados ex-vivo, tecidos de estudos animais in vivo, bactérias, leveduras, peixes-zebra e insetos.

Q: As amostras podem ser congeladas após a fase de aquecimento?

A: This is possible, however this requires a case-by-case validation as the freezing process can denature some proteins.

Q: As minhas células necessitam de revestimento em placa de cultura com algumas proteínas (ex. colagénio ou Matrigel); é necessário um cuidado especial para evitar a preparação da amostra?

A: não encontrámos quaisquer problemas com células cultivadas em placas revestidas.Condições de ensaio

CETSA® condições de ensaio

Q: Quais são os pontos típicos de optimização do doseamento Alpha CETSA®?

A: se começar do zero, o imunoensaio precisa ser desenvolvido e optimizado primeiro. É importante e vale a pena investir no desenvolvimento de um teste alfa muito sensível, pois permitirá reduzir o número de células por bem necessário no teste CETSA®. Como o teste CETSA® está destruindo parte da proteína que precisa ser detectada, normalmente mais células/bem são necessárias em um teste CETSA® em comparação com outros testes baseados em células. Por favor, consulte os guias PerkinElmer para o desenvolvimento do ensaio alfa para saber como proceder e para dicas úteis, e os manuais da caixa de ferramentas CETSA® se usar a abordagem da caixa de ferramentas (contas anti-rato Ig X anti-coelho Ig).

depois, os pontos de optimização do doseamento CETSA® incluem::

• Célula densidade de titulação
• Selecção de tampão de lise celular
• tempo de Incubação das células com o teste composto
• Temperatura de incubação das células com o teste composto
• Estabelecimento de derreter e curvas do deslocamento
• Selecção de temperatura isotérmica de dose-resposta experimentos
• Fluxo de trabalho e automação de definições

Q: Por que são diferentes CETSA® lise celular buffers fornecido e qual é o impacto do uso de diferentes lise celular buffers?

A: O tampão de lise é importante em relação a vários aspectos do ensaio. O seu papel é múltiplo: lisar as células e libertar potencialmente a proteína alvo das proteínas parceiras que podem interferir com o reconhecimento de anticorpos, a fim de disponibilizar o alvo para detecção pelos anticorpos; estabilizar a proteína alvo para tornar o ensaio estável; evitar ou minimizar o potencial efeito de epiturbância; oferecendo a melhor forma de físico-química condições (pH, força iônica e a natureza dos sais, detergentes tipo e concentração, … ) para o imunoensaio, … Como diferentes imunoensaios podem ter diferentes condições ideais, e como diferentes alvos de proteína, e diferentes tipos de células podem ter diferentes requisitos para o melhor desempenho do ensaio, estamos fazendo 5 diferentes lise celular buffers disponíveis. Estes fornecem uma variedade de condições de lise celular. No entanto, tal não implica que possam ser adicionados componentes adicionais em casos específicos, como tipos adicionais de detergentes, para melhorar o desempenho doseamento.

Q: existem inibidores da protease nos tampões de lise das células CETSA®?

A: tampões de Lise celulares CETSA® 1, 4 e 5 contém alguns quelantes de catiões divalentes, que se espera inibam as proteases que requerem tais catiões divalentes para a sua actividade (metaloproteinases de matriz, por exemplo). Além disso, não estão incluídos outros inibidores da protease nos tampões de lise das células CETSA®, uma vez que estes geralmente não são necessários para o desempenho dos ensaios Alfa CETSA®. No entanto, para tipos específicos de células ou amostras de tecidos, pode querer adicionar inibidores típicos da proteinase, tais como a leupeptina.

Q: Quais são as temperaturas de fusão típicas?

A: a temperatura de fusão (Tm) é definida como a temperatura a que metade da população de proteínas alvo foi desnaturada (ou seja, em Alfa CETSA®, a que se perdeu metade do sinal Alfa). Dependendo do alvo, as temperaturas de fusão são na maioria das vezes entre 40°C e 60°C, com uma temperatura média de fusão de 52°C. algumas proteínas, como proteínas associadas à membrana, são geralmente mais estáveis e podem ter uma temperatura de fusão mais elevada. Os dados do ensaio CETSA® para proteínas com uma temperatura de fusão superior a 65°C podem ser afectados pelo facto de a permeabilidade da membrana e a integridade celular serem perturbadas quando as células são aquecidas, o que afecta o significado fisiológico do ensaio.Na nossa experiência, a temperatura de fusão é específica do alvo e depende da matriz do ensaio e do tampão de lise utilizado.

Q: espera-se que a Tm seja a mesma quando se trabalha com células intactas e células perturbadas?

A: não necessariamente, como quando interrompe as células, interações proteína-proteína que estabilizam proteínas podem ser perdidas, o que pode levar a uma temperatura de fusão alterada em comparação com as células intactas. Por exemplo, consulte os dados do ensaio Alpha CETSA® MEK1.

Q: Que temperatura de aquecimento devo escolher para testes compostos?

A: Para estabilizar os compostos, recomenda-se a escolha da temperatura mais baixa com a maior janela do ensaio, uma vez que se espera que o ensaio seja o mais sensível (valores de CE50 inferiores). Para destabilizar compostos é recomendado selecionar a temperatura mais alta com a maior janela do ensaio. Temperaturas acima de 65 ° C podem ter um impacto na permeabilidade celular e reduzir o significado dos dados.

Q: devo esperar a mesma temperatura de fusão em CETSA® Classic (Western Blot) e Alpha CETSA®?

A: não necessariamente: a temperatura aparente de fusão pode variar entre os dois métodos, pois os métodos de detecção são diferentes.

Q: é importante ter um controlo rigoroso dos tempos de aquecimento das amostras?

A: Sim, isto é extremamente importante para controlar uma vez que os tempos de aquecimento Mais longos podem resultar num desvio correcto da curva dose-resposta (ver abaixo os comentários sobre o tempo de residência). O tempo de aquecimento padrão é de 3 minutos.Compostos com um tempo de residência curto (isto é, elevada taxa de dissociação constante do koff); o tempo de residência T sendo igual a 1 / koff) irá dissociar-se mais rápido do alvo quando é aquecido, em comparação com compostos com um longo tempo de residência. Por esta razão, espera-se que o valor CE50, ou ITDRF50, aumente com o aumento dos tempos de aquecimento. Para mais explicações sobre a teoria CETSA® ver Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbäck T. (2018) interpretação quantitativa da ligação intracelular ao fármaco e Cinética utilizando o ensaio de mudança térmica celular. Biochemistry 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. Em teoria, a detecção de diferentes tempos de residência compostos no alvo, por variar o tempo de aquecimento poderia ser possível, mas ainda não há relatórios publicados sobre isso ter sido feito.

Q: o manual dá instruções para arrefecer no gelo, ou durante 3 minutos a 25°C após o choque térmico. Este passo de resfriamento é importante e é importante ter um controle rigoroso do tempo de resfriamento?

A: arrefecer rapidamente a amostra garante que a fase de choque térmico está bem controlada. Simplesmente permitir que as temperaturas esfriem sem ajuda certamente produziria diferentes taxas de resfriamento em diferentes poços e afetaria a quantidade de choque de calor entregue ao sistema. A fase de arrefecimento não é tão crítica como a fase de aquecimento, mas deve ser conduzida de forma rápida e consistente.

Q: Posso utilizar kits PerkinElmer” Biomarker” e “SureFire” (não CETSA® ) para efectuar um ensaio CETSA®?

A: em teoria, qualquer doseamento de proteína total pode ser adequado para utilização num protocolo CETSA®, embora cada sistema precise de ser optimizado e validado. No entanto, o método CETSA® é patenteado e a permissão será necessária da Pelago Bioscience. Além disso, apenas a utilização dos kits-alvo designados é suportada pelo PerkinElmer. O uso do kit de caixa de ferramentas é suportado pela Pelago Bioscience e só está disponível para titulares de licença.

Q: É possível ler o sinal Alfa directamente da placa PCR utilizada para aquecer as amostras?

R: Isto traria vantagens em termos de número de fases de tubagem, consumo de amostras e facilidade de automatização, mas a possibilidade de utilizar placas PCR para todo o processo – desde o tratamento da amostra até à detecção – ainda não está demonstrada. Placas PCR são muitas vezes muito flexíveis, levando a um sinal não uniforme sobre a placa, ou não têm as dimensões certas para permitir que eles sejam manuseados por leitores de placas. Conversas cruzadas entre bem e bem também podem ser um problema em tais placas PCR.

Q: Pode utilizar-se a desnaturação química (por exemplo, utilizando ureia ou guanidina) em vez do calor?

A: A vantagem de usar a temperatura para entregar o choque de calor é que ele é feito de uma forma altamente controlada, que é provável que seja constante entre amostras, e limitado ao longo de um período de tempo bem controlado. Um processo de desnaturação química pode funcionar num extracto proteico purificado, mas no complexo ambiente celular, a variação do volume celular, a capacidade tampão, o teor de lípidos, etc., são susceptíveis de significar que as diferentes linhas celulares apresentam características de desnaturação diferentes para uma determinada proteína.

como a desnaturação (tempo de aquecimento) é crítica, isto pode ser bastante difícil de controlar se usar a desnaturação química. Além disso, o calor pode ser aplicado sem perturbar as células, permitindo testar no contexto celular real. Este não seria o caso da desnaturação química, uma vez que as células teriam de ser interrompidas para permitir o acesso alvo ao agente desnaturante, perdendo assim concentrações intracelulares, associações proteicas, etc.. Portanto, não recomendamos a substituição do choque térmico por desnaturação química.

Alpha CETSA® Immunoassay

Q: Ao desenvolver um teste de CETSA®, preciso de anticorpos monoclonais ou também de anticorpos policlonais?

A: podem ser utilizados anticorpos monoclonais ou policlonais, dependendo, naturalmente, da qualidade dos anticorpos. Os anticorpos monoclonais apresentam uma vantagem em termos de fornecimento estável de reagente, como para qualquer outro método de detecção que utilize anticorpos.

Q: ao utilizar anticorpos policlonais, o próximo lote irá funcionar da mesma forma num teste CETSA®?

A: Na nossa experiência, nunca enfrentamos uma situação em que o próximo lote de um anticorpo policlonal se comportasse de forma diferente no ensaio CETSA® em comparação com os lotes anteriores. No entanto, o ensaio CETSA® tem de ser reavaliado com o lote seguinte do anticorpo policlonal.

Q: existem outras recomendações para a selecção de anticorpos?

A: se disponíveis, os anticorpos devem ser selecionados de modo a cobrir diferentes epítopos da proteína alvo, a fim de maximizar as chances de encontrar um par de anticorpos adequado que funcionará no teste alfa CETSA®.

os pares de anticorpos que produzem curvas mais íngremes (declive mais alto) e menos fundo são preferidos, uma vez que normalmente fornecem um sinal mais específico. A encosta baixa pode ser o sinal da capacidade de um par de anticorpos reconhecer a proteína dobrada.

Q: Os anticorpos Alfa CETSA® são apenas contra a proteína alvo endógena ou a proteína alvo endógena mais uma pequena molécula ligada?

A: com base nos kits desenvolvidos até agora, os anticorpos são apenas contra o alvo proteico.

Q: Posso esperar que as afinidades de anticorpos de detecção sejam diferentes entre a pequena molécula ligada e não ligada para atingir a proteína?

A: pequenas moléculas que influenciam a dobragem de proteínas nos locais de epítopo estão, de facto, em risco de alterar a ligação de anticorpos. Este fenômeno é chamado de “epiturbância” e pode ser uma limitação da base de anticorpos-CETSA® . Em geral, a Epiturbance não é observada no formato de doseamento clássico CETSA® (Western Blotting), uma vez que neste caso a proteína é totalmente desnaturada antes do passo de detecção de anticorpos.

Q: Pode apenas utilizar IgG com os kits de ferramentas CETSA®?

A: De facto, os anticorpos das esferas anti-coelho e anti-rato são específicos da IgG e não reconheceriam outras classes de anticorpos (isto é, IgA, IgM, etc.não devem ser seleccionados).

Q: Existe uma vantagem em utilizar o Alpha CETSA® em comparação com o CETSA® Classic (Western Blotting)?

A: Para além de uma maior sensibilidade do ensaio Alpha CETSA® e de considerações de rendimento e automatização, devido à possível dificuldade em analisar proteínas de membrana no método clássico CETSA®, o Alpha CETSA® pode ter um melhor desempenho para esses alvos, uma vez que não necessita de qualquer etapa de separação.

CETSA® Data Analysis and Interpretation

Q: What false positive hits can be obtained in CETSA®?

A: a estabilidade térmica de algumas proteínas pode ser afetada após o tratamento composto, apesar de não estarem diretamente ligadas pelo composto de ensaio. Estes efeitos indiretos podem ser o resultado, por exemplo, da fosforilação proteica, do recrutamento de proteínas por uma proteína parceira, ou da mudança geral do Estado Redox da célula. Executar o ensaio CETSA® em paralelo em células intactas e em células perturbadas pode discriminar entre efeitos diretos e indiretos, uma vez que tais efeitos indiretos não são esperados quando as células são interrompidas e os processos metabólicos são interrompidos.

a intereferência de doseamento composto pode ser encontrada em Alpha CETSA®, uma vez que os compostos estão presentes na etapa de detecção em uma concentração relativamente alta. Isto pode dar resultados enganosos e é importante realizar uma contra-Tela para identificar esses compostos.

Q: Como se pode interpretar a desestabilização do alvo?

A: A desestabilização pode resultar da ruptura pela ligação composta de um complexo proteico que estava estabilizando a proteína alvo. Na nossa experiência, as proteínas de membrana geralmente têm uma temperatura de fusão mais elevada e são mais desestabilizadas do que estabilizadas pela ligação de compostos. Para os cinases, também pode resultar do deslocamento de ATP. Nesse caso, pode ser útil comparar o resultado dos testes CETSA® quando realizados em células intactas (concentrações ATP fisiológicas) e células perturbadas (perda de ATP). Para alguns alvos (ver o manual ErbB2 Alpha CETSA® kit), observámos que os inibidores irreversíveis estavam a desestabilizar o alvo enquanto um inibidor reversível estava a estabilizar o alvo.Q: Existe uma maneira de evitar o efeito de epiturbância?

A: adicionar uma pequena quantidade de detergente, como 0,01% SDS, pode prevenir o fenômeno de epiturbância. Uma explicação pode ser que a SDS está fornecendo acesso ao anticorpo mesmo na presença do composto. Alguns dos tampões de lise celulares CETSA® contêm uma pequena quantidade de SDS e, portanto, podem evitar a epiturbância em relação a outros tampões de lise. Não podemos excluir que, em alguns casos, possa ser necessário acrescentar mais SDS.

note-se que tal efeito de epiturbância não se limita aos ensaios com CETSA®, mas também pode ser encontrado em qualquer imunoensaio.

Q: contra-ecrã / como verificar se o impacto do CETSA® é um falso positivo?

A: em CETSA® , existe um método simples que permite determinar se o composto actua na própria estabilização da proteína-alvo (de)ou interfere com o método de detecção .: uma comparação pode ser feita entre (1) adição dos compostos às células, então incubando e fazendo o tratamento térmico e (2) aquecendo as células primeiro e adicionando o composto apenas depois. Se a atividade composta é encontrada apenas no teste 1, então ela é realmente ativa no alvo. Se a actividade do composto é encontrada em 1 e 2, então mostra que interfere de alguma forma com a tecnologia de detecção (consulte o Guia de interacção Proteína-Proteína PerkinElmer para uma lista de potenciais interferências Alfa).

Q: Que resultados falsos negativos podem ser obtidos em CETSA®?

A: Se um composto não está atingindo o alvo em um contexto celular, pode parecer positivo em ensaios bioquímicos, e ainda ser negativo em CETSA® . Isto não é um falso negativo, mas apenas refletindo o fato de que o composto não é capaz de acessar o alvo em condições celulares reais, o que faz parte da potencialidade do método.

Q: Como os valores de CETSA® se comparam com os ensaios funcionais / existe um significado da amplitude do termóstato?

A: Ao analisar os dados do CETSA®, deve-se ter em mente que o princípio do ensaio é bastante diferente dos ensaios funcionais típicos, tais como a análise da fosforilação de proteínas, concentrações de iões, marcadores de campo e outros marcadores de transdução de Sinais, ou análise fenotípica na triagem de alto conteúdo, e, portanto, os dados devem ser interpretados em conformidade.

a amplitude do termóstato não é uma medida da afinidade composta.Os valores CE50 ou ITDRF50 são específicos de determinadas condições de ensaio (temperatura, tempo de aquecimento, …). Isto não é diferente dos ensaios funcionais, em que os valores CE50 são, por exemplo, específicos dos tempos de estimulação.É possível discriminar antagonistas Versus agonistas nos ensaios de CETSA®?

A: Normalmente não se trata de uma informação extraída dos ensaios CETSA®, mas sim da publicação de Shaw et al. (2018) Relatórios Científicos / (2018) 8: 163/DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. relatórios de que apenas os agonistas foram capazes de estabilizar o receptor androgénico no ensaio CETSA® desenvolvido, enquanto os antagonistas não tiveram efeito directo no ensaio CETSA®, mas puderam ser detectados como concorrentes do efeito dos agonistas no ensaio CETSA®. Assim, neste caso particular, o ensaio CETSA® foi capaz de discriminar entre agonistas androgénicos e antagonistas dos receptores. Isto não implica que tal seja possível para qualquer alvo, uma vez que existem inúmeros exemplos em que o ensaio CETSA® detecta directamente agonistas e antagonistas.

Q: Pode o CETSA® ser utilizado para detectar a toxicidade de um composto?

A: Compostos que exercem algum efeito tóxico em uma célula são esperados para levar para a mudança no nível de algumas proteínas (via de degradação e/ou transcrição de efeitos) e as mudanças na estabilidade térmica de algumas proteínas (através de modificações pós-traducionais ou geral, alteração do estado Redox das células). Pelago está explorando a possibilidade de gerar “impressões digitais CETSA®” que podem estar ligadas a diferentes tipos de toxicidade, a partir de dados CETSA® MS. Isto também pode gerar conhecimento de metas que os medicamentos não devem atingir para evitar tal toxicidade. Se um alvo específico parece estar ligado à toxicidade, então o uso de Alpha CETSA® pode tornar-se um método de escolha para a indústria farmacêutica.

Q: Pode ser utilizada uma proteína doméstica para a normalização dos ensaios CETSA®?

A: Normalmente não é necessária normalização nos ensaios CETSA®, uma vez que o resultado importante do ensaio é o valor CE50. No entanto, em alguns casos, por exemplo, ao trabalhar com amostras de tecido, a quantidade de material envolvido por ponto de dados pode variar bastante significativamente e normalização pode então ser desejada. Em CETSA® Classic (Western blotting), SOD1 é comumente usado como seu ponto de fusão de 80°C faz dele uma boa referência invariável para qualquer alvo, e como seu peso molecular de 18 kDa torna fácil de detectar em blots ocidentais. GAPDH não seria recomendado devido à sua menor temperatura de fusão (55 °C), tornando-se impossível um controle para alvos com uma maior temperatura de fusão.

se se quiser normalizar o doseamento Alfa CETSA®, pode tentar-se o cofilin (existe um kit AlphaLISA SureFire ultra para a cofilina total, com dados preliminares de CETSA® mas ainda não está completamente validado)