Anticorpos segmentação de claudin-1 como um potencial de câncer colorretal terapia

CRC amostras

Para a expressão do gene de criação de perfis, foram selecionados 143 amostras de tumores de 143 pacientes incluídos em três grupos: o potencial de um único centro de estudo do REGP (19 pacientes) (GSE62322) , a retrospectiva estudo multicêntrico COSIVAL (68 pacientes) e o estudo multicêntrico prospectivo BIOCOLON (56 pacientes) (GSE62080 e GSE72970) . Para estes três estudos, os critérios de inclusão foram: adenocarcinoma do cólon histologicamente comprovado, tumor avançado e bidimensionalmente mensurável (estágio IV), idade entre 18 e 75 anos, e estado de desempenho da Organização Mundial de Saúde (OMS) ≤2. Antes de qualquer tratamento, todos os pacientes foram submetidos a cirurgia para ressecção primária do tumor ou biópsia endoscópica.

para a análise western blot, foram utilizadas 13 amostras adicionais de tumor do estudo prospectivo de um único centro REGP, mas não incluídas nas 143 amostras.

para a análise imunohistoquímica, amostras de tecidos de 52 doentes adicionais com CRC foram seleccionadas retrospectivamente do Institute of Cancer Research de ficheiros patológicos Montpellier apenas quando amostras de mucosa, adenoma e adenocarcinoma normais estavam disponíveis para o mesmo doente.

todos os estudos que utilizaram amostras de tecido humano foram aprovados pelos comités de ética relevantes e todos os participantes foram informados sobre os objectivos e métodos do estudo e assinaram um consentimento informado por escrito antes da inscrição.

análise da expressão genética

Cólon amostras (normal do cólon, tumor primário e metástases hepáticas amostras para o REG/P estudo, mas apenas tumor primário espécimes para o COSIVAL e BIOCOLON ensaios) foram coletados no momento da cirurgia seguir um procedimento padronizado para obter alta qualidade de RNA . As amostras foram então hibridizadas com o genoma humano U133 mais matrizes 2.0 (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

para identificar novos alvos terapêuticos para a terapêutica à base de anticorpos na mCRC, comparamos os perfis de expressão genética da mucosa normal (n = 17), tumor primário (n = 20) e metástases hepáticas (n = 19) amostras de tecido.

como a heterogeneidade da CRC deve ser tida em conta ao comparar perfis de expressão genética, as amostras primárias de tumores (n = 143) foram classificadas utilizando as classificações moleculares da CRC baseadas em perfis de expressão genética que foram propostos por três grupos independentes e a recente classificação consensual . Brevemente, de Sousa E. Melo et al. proposta para agrupar tumores em três classes: CCS1 (CRC com instabilidade microssatelita, MSI), CCS2 (câncer com instabilidade cromossômica, CIN) e CCS3 (novo subtipo) . Sadanandam et al. identificou cinco subtipos moleculares, com base no fenótipo celular: Tipo cálice, amplificação em trânsito (TA), enterócito, tipo tronco e inflamatório . Marisa et al. seis subtipos moleculares descritos (C1 a C6) com as seguintes características principais:: C1 = CIN e desregulação das vias imunitárias, C2 = MSI, C3 = KRAS mutado, C4 = fenótipo de células estaminais, C5 = CIN e upregulação das vias WNT, e C6 = CIN e perfil de expressão do gene normal . Finalmente, a partir de seis assinaturas publicadas anteriormente, um consórcio internacional apresentou uma classificação com quatro subtipos de consenso: MSI (CMS1), canônico (CMS2), metabólico (CMS3), e mesenchymal (CMS4) (para revisão ). A distribuição da amostra CRC de acordo com o subtipo molecular é apresentada no ficheiro adicional 1: Tabela S1.

a análise imunohistoquímica

as amostras foram montadas numa micro-matriz tecidular (TMA) utilizando três núcleos tecidulares (0,6-mm de diâmetro cadA), como descrito anteriormente . Brevemente, as secções de 3 µm da TMA foram des-parafinizadas e reidratadas em álcoois classificados. A extracção do antigénio induzido pelo calor foi realizada incubando secções TMA em tampão EDTA (pH 9) a 98 °C num banho de água durante 20 minutos. Após a neutralização da actividade endógena da peroxidase, as secções TMA foram incubadas apenas com um anticorpo policlonal anti-CLDN1 (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, EUA) ou com um diluente de anticorpos (Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 60 minutos. A ligação primária de anticorpos foi visualizada utilizando o sistema Envision® e o Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Dinamarca). A percentagem de células cldn1 positivas e a intensidade de coloração (0, sem coloração; 1, amarelada; 2, castanha; e 3, castanha escura) foram avaliadas para cada ponto TMA individual.

Western blot

tecido Tumoral a partir de amostras de pacientes foram diretamente moídas em tampão de lise (150 mM NaCl, 10 mM de Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, EGTA 1 mM, 1% SDS, 1% Triton X-100, DE 0,5% NP-40, de 2 mM de PMSF, 100 mM NaF, 10 mM de ortovanadato de sódio, um coquetel inibidor da protease tablet para 10 ml), utilizando um Misturador de Moinho® MM 300 unidade (Qiagen, Valencia, CA). A concentração de proteínas foi determinada com o doseamento de Bradford (Pierce Coomassie Plus Protein Assay). Em seguida, 50 µg de proteínas totais foram resolvidos em 12% SDS-PAGE e transferidos para membranas nitrocelulose (Whatman® Protran®, tamanho dos poros 0,45 µm). Os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 5% (wt/vol) de leite magro em PBS com 0, 1% (vol/vol) Tween 20 (PBS-T) à temperatura ambiente durante 1 h E depois as membranas foram incubadas a 4 °C com um anticorpo policlonal anti-CLDN1 (JAY-8) durante a noite. As membranas foram então lavadas e incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase-rábano apropriado durante 1 h. A revelação foi realizada com um sistema de quimioluminescência (Biociências de Amersham); a expressão β-tubulina foi utilizada para a normalização.

a extracção de proteínas subcelulares

foi efectuada tal como descrito anteriormente . Para cada amostra, secções de 20 µm de espessura foram cortadas com um criotoma, misturado com azoto líquido e moído suavemente com um micro-pilão. Para a extração de proteínas subcelulares, o Kit de extração Proteoextra foi usado de acordo com as instruções do fabricante (Calbiochem). As fracções subcelulares (10 µg/cada) foram carregadas em géis de 12% de páginas-SDS. Immunoblotting foi feito como descrito acima, com os seguintes anticorpos primários: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Histona H3 (Pierce) e -β-tubulina (Sigma T4026).

linhas de Células

O seguinte humanos CRC linhas de células foram usadas: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (um presente de C. Montagut, do Departamento de Oncologia Médica, Hospital del Mar, Barcelona, Espanha), HCT116 (CCL-247), e LS174T (ATCC CL-188). Para obter o CLDN1-positivo SW480 linha celular (SW480-CLDN1), SW480 células foram estável transfected com os humanos CLDN1 clone de cDNA (Invitrogen MGC coleção) ou com o vetor vazio (pcDNA) usando o jetPRIME™ transfection reagent (Polyplus-transfection Inc., Franca). Os clones CLDN1-positivos foram seleccionados através do crescimento de células transfectadas na presença de 500 µg/ml de geneticina. For CLDN1 silencing, SW620 was transduced with the pSIREN vector containing the shRNA against CLDN1 (SW620shCLDN1) or against luciferase (shLUC, negative control). Após 24 h, as células foram seleccionadas com 1 µg/mL de puromicina e foram agrupados clones estáveis. Todas as transfusões transitórias foram feitas usando o reagente de transfecção jetPRIME™.

Produção de anti-CLDN1 mAb 6 F6

Para a produção de anticorpos, de 6 a 8 semanas de idade, do sexo feminino BALB/c ratos (Harlan, Gannat, França) foram desafiados por intra-peritoneal (que eu.p.) injeção de 4 milhões de mouse NIH células transitoriamente transfected com CLDN1 cDNA (NIH-CLDN1 células) a cada duas semanas (cinco injeções no total). As células NIH-CLDN1 foram misturadas com o adjuvante completo de Freund (Sigma) para a primeira injecção, e com o adjuvante incompleto de Freund (Sigma) para as outras quatro injecções. Foi administrada uma injecção intravenosa de reforço das células NIH-CLDN1 três meses após a quinta imunização. Três dias depois, as células do baço de ratinhos imunizados foram fundidas com a linha celular P3-X63-Ag do mieloma do Ratinho.8,653 para produzir hibridomas de rato. Os sobrenadantes de clones recém-gerados foram rastreados por separação de células activadas por fluorescência (FACS) utilizando células SW480-CLDN1 e SW480 (controlo negativo). Os resultados do rastreio foram confirmados através da realização de um rastreio adicional utilizando células SW620 e SW620-shCLDN1. O clone anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 foi seleccionado e clonado por diluição limitada. A isotipagem de anticorpos mostrou que 6 F6 era um IgG3k.

todas as experiências com animais foram realizadas em conformidade com as diretrizes do governo francês para estudos experimentais em animais (acordo CEEA-LR-12052).

Radiolabeling and SPECT-CT imaging

Female athymic nude mice (6-8-week-old) were purchased from Harlan. O 6 F6 mAb foi marcado radioactivamente com 125I (Perkin Elmer) na actividade específica de 370 MBq/mg para a tomografia computadorizada de emissão de fotões únicos (SPECT), utilizando a IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) metodo. Após a injecção da veia de cauda de 16 MBq / 50 µg 125I-rotulado 6 F6, A tomografia de emissão de fotões simples de corpo inteiro/tomografia computadorizada (SPECT/CT) foram adquiridas imagens com uma câmera NanoSPECT multi-pinhole multiplexante de 4 cabeças (Bioscan Inc.)., Washington, EUA) em diversas ocasiões (48, 72 e 96 h). Concomitantemente, foram obtidas imagens micro-CT de todo o corpo para o co-registo anatómico com dados SPECT. Os dados de SPECT reconstruídos e CT foram visualizados e co-registrados usando Invivoscope®.

Clonogenic composição

câncer Colorretal células foram semeadas em um 6-bem prato (150, 250 ou 400 células/poço) e permitido para aderir a 37 °C durante a noite. Em seguida, adicionou-se 1 ml de IPR com ou sem 6 mAb F6 (concentração final: 100 µg/ml) a cada poço e as células foram cultivadas durante seis dias. Após mais seis dias em meio sem anticorpos, as placas foram lidas usando um citômetro de imagem Celigo™ e a aplicação” verificação de uma única colônia”. O citômetro Celigo™ é um sistema de análise celular in situ que fornece imagens de poços usando iluminação de campo brilhante (Nexcelom Bioscience, MA, EUA).

Establishment of three-dimensional (3D) spheroid cultures

Ultra-low attachment, round-bottomed 96-well plates (Corning Costar) were used for spheroid formation. As células SW480, SW480-CLDN1 ou SW620 foram semeadas com uma densidade de 5 × 104. Células agregadas e fundidas em spheróides 3D dentro de 24-72 h. Imagens de poços foram tiradas com um microscópio de contraste de fase usando um objetivo de 5× ou captadas com o citômetro de imagem Celigo™ usando a aplicação “Tumorosfera”. A viabilidade celular foi avaliada com o ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, EUA). Após a adição de 100 µl de reagente Glo de célula a cada poço durante 10 minutos, a luminescência foi medida num leitor de microbeta TriLux de luminescência (Perkin Elmer) com luminescência de 1450.

ciclo Celular e proliferação de análise em esferóides

Esferóides foram preparadas pelo chapeamento de 1000 DiFi células por poço em ultra-baixa anexo 96-placas, e crescer na presença de 100 µg/ml de 6 F6 mAb ou irrelevantes mAb (retuximab) por 5 dias. Para a análise do ciclo celular, as células foram peletizadas, tripsinizadas, lavadas com PBS, fixadas em etanol a 75% e manchadas com iodeto de propídio de 40 µg/ml na presença de 100 µg de ml−1 RNAse (Qiagen). A distribuição do ciclo celular foi determinada com um Citómetro de fluxo de Beckman de FC500 usando o canal FL-3. As células foram gravadas num gráfico de pontos que mostrava o pico do ADN-pulso versus a área do ADN-impulso para excluir duplicados. Distribuições do ciclo celular foram ilustradas usando o software de Análise de fluxo Jo (Treestar, FLOWJO, Ashland, ou, EUA).

no dia 4 da cultura, a proliferação celular foi medida incubando as células com 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) durante 24 horas. o EdU é incorporado no ADN durante a síntese activa do ADN. Depois, após tripsinização celular e fixação/permeabilização em 75% de etanol/PBS, o EdU incorporado foi rotulado e detectado com o Kit de teste de citometria de fluxo (Invitrogen) Click-iT EdU Alexa Fluor 488. As células foram então incubadas com 1 µg/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS/0, 1% Triton X100 a 37 °C durante 30 minutos. A aplicação Celigo™ “Análise de expressão” (Alvo 1 + máscara) foi usada para quantificar o sinal fluorescente e para a análise de dados. As células foram identificadas utilizando a mancha nuclear de DAPI e a síntese de ADN foi quantificada através da medição da incorporação de EdU.

Mouse xenograft modelos

1,5 x 106 SW620 células ou 3 × 106 DiFi células foram suspensas em meio de cultura e injetado por via subcutânea (s.c.) no flanco direito, de 6 a 8 semanas de idade, do sexo feminino athymic nude ratos de Harlan. Quando o tumor volume atingiu cerca de 100 mm3, os ratos foram divididos aleatoriamente em diferentes grupos e tratados por eu.p. injeção de 0,9% de NaCl, ou 6F6 mAb (15 mg/Kg por injecção), duas vezes por semana durante três semanas consecutivas, para o primeiro experimento e três vezes por semana para o segundo experimento. Os tumores foram medidos duas vezes por semana com um paquímetro e volumes calculados com a fórmula: D1 x d2 x D3/2.

modelo de colonização hepática Intrasplénica

em cada experiência, 2 milhões de células SW620 (células SW620-LUC) expressoras de luciferase foram injectadas no baço de ratinhos atimicos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade. O baço foi removido 2 minutos após a injecção de células. No dia 1 após a injecção, os ratinhos foram aleatoriamente divididos em dois grupos de 10 ratinhos que foram tratados com 15 mg/kg de 6 mAb F6 ou com 0, 9% de NaCl por injecção I. p., três vezes por semana. Para avaliar a formação e disseminação metastáticas, a expressão da luciferase foi monitorizada por imagens de luminescência após a injecção de luciferina (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) uma vez por semana. Na 5ª semana após a cirurgia, os ratos foram sacrificados, os fígados foram removidos, fotografados e foram contadas metástases macroscopicamente visíveis na superfície do fígado.

a análise estatística

a análise estatística foi feita usando o software STATA 13.0 (StataCorp). Para a expressão genética ou experiências imunohistoquímicas, as diferenças entre grupos foram analisadas usando o teste de Kruskall Wallis/Dunn. As correlações entre a expressão do gene CLDN1 e a sobrevivência livre de progressão (PFS) e a sobrevivência global (OS) foram avaliadas em todo o grupo (n = 143 doentes) e de acordo com o subtipo molecular tumoral. Para este fim, os 143 doentes foram divididos em dois grupos com base na expressão mediana do gene CLDN1 (ou seja, 9, 75 ). Os valores de PFS e OS foram comparados utilizando o método Kaplan-Meier e as diferenças entre as distribuições de sobrevivência avaliadas utilizando o teste log-rank.

o teste t emparelhado foi utilizado para comparar o efeito da incubação com o 6 mAb F6 em experiências in vitro.

in vivo experiments, a linear mixed regression model was used to determine the relationship between tumoral growth and number of days after injection. A parte fixa do modelo incluía variáveis correspondentes ao número de dias pós-enxerto e a diferentes grupos de tratamento. Termos de interação foram incorporados ao modelo; interceptações aleatórias e inclinações aleatórias foram incluídas para levar em conta o efeito de tempo. Os coeficientes do modelo foram estimados pela máxima probabilidade. As taxas de sobrevivência foram estimadas desde a data da injeção até a data em que o tumor atingiu um volume de 1500 mm3 usando o método Kaplan–Meier. As curvas de sobrevivência foram comparadas utilizando o teste log-rank. Para as experiências de colonização hepática, as diferenças entre os grupos foram avaliadas com o teste de Mann-Whitney U. Para todas as experiências, as diferenças foram consideradas significativas quando P < 0, 05.