Chloranfenicol acetiltransferase as a selection marker for chlamydial transformation
pGFP:: SW2, the shuttle vector constructed by Wang et al, contained a β-lactamase gene as a selection marker. Ele também carrega um gene de gato que é fundido ao gene GFP . Nós descobrimos que E. coli transformado com o pGFP:: plasmídeo SW2 foi capaz de crescer em meio contendo cloranfenicol (concentração final: 170 µg / ml), sugerindo que o gene do gato também pode ser usado como marcador de seleção para experiências de transformação clamidiana. Como advertido por Wang et al., um efeito adverso do cloranfenicol na mitocôndria Hospedeira, como demonstrado por Li et al. pode afetar a utilidade deste antibiótico para a transformação clamidiana . In Li et al.no relatório, a concentração tóxica mínima de cloranfenicol foi de 10 µg/ml, o que causou uma ligeira redução de 20% na produção de ATP. Determinamos que a aparente menor concentração de cloranfenicol que inibiu completamente a formação de inclusão no plasmídeo C. a estirpe L2 trachomatis designada L2R foi de apenas 0, 05 µg/ml (dados não apresentados), que foi muito inferior às concentrações tóxicas para as células hospedeiras. Portanto, nós argumentamos que este antibiótico poderia ser usado para selecionar transformadores que expressam gatos sem stressar significativamente as células hospedeiras.
nós transformamos L2R com pGFP:: SW2, e selecionamos metade das células transformadas com ampicilina, e a outra metade com cloranfenicol. Os antibióticos (2 µg/ml de ampicilina ou 0, 1 µg/ml de cloranfenicol) foram adicionados às culturas às 10 horas após a transformação. A partir da passagem 2, as suas concentrações aumentaram para 5 e 0, 2 µg/ml, respectivamente, e foram adicionadas no momento da inoculação. A razão de separação entre passagens permaneceu 1: 1 da passagem 1 embora a passagem 4. Embora a MIC de cloranfenicol, que foi determinada em baixa multiplicidade de infecções (~0.1 unidades formadoras de inclusão por célula), foi de 0,05 µg/ml, algumas das clamidiae não traduzidas foram esperadas para formar inclusões na presença de 0.1-0.2 µg / ml o antibiótico, porque usamos uma elevada relação EB / célula para a transformação, e a eficácia da inibição do crescimento clamdial por antibióticos é influenciada pela multiplicidade de infecções . Com o protocolo de seleção acima descrito, em culturas selecionadas com ampicilina, sob um microscópio de contraste de fase, quase 100% das células foram encontradas para conter uma inclusão com RBs aberrantes na passagem inicial. As inclusões aberrantes contendo RB ainda estavam presentes em uma pequena proporção de células na passagem 2, mas foram substituídas principalmente por inclusões aparentemente normais na passagem 3. Inclusões normais foram encontradas em cerca de 20% das células, e inclusões anormais raramente foram observadas na passagem 4. Na passagem 5, que resultou da inoculação com 10% de colheita da passagem 4, inclusões foram encontradas em 80% de células; aparentemente, nenhuma dessas inclusões continha RBs aberrantes.
uma vez que o cloranfenicol não faz com que as chlamydiae formem RBs aberrantes, julgámos a resistência ao antibiótico pelo tamanho da inclusão. Inclusões de tamanhos menores do que o normal foram detectadas em quase todas as células na passagem 1. Algumas, mas muito pequenas, inclusões foram encontradas na passagem 2, e a maioria dessas inclusões foram substituídas por inclusões de tamanho normal pela passagem 3. Inclusões de tamanho Normal foram encontradas em mais de 20% de células na passagem 4. Na passagem 5, derivada após inoculação com 10% de passagem 4 colheita, e um aumento na concentração de cloranfenicol (de 0,2 µg/ml para 0,5 µg/ml), foram encontradas inclusões de tamanho normal em quase 100% de células 0000000.
além da resistência aparente aos agentes de seleção, usamos a expressão GFP e a restauração da síntese de glicogênio como marcadores adicionais para uma transformação bem sucedida . Os EBs colhidos da passagem 5 foram utilizados para infectar as células McCoy a uma taxa de diluição de 1:100 (equivalência do número de células) para experiências que determinaram a expressão do GFP e a síntese do glicogénio (Figura 2). Tal como esperado, nem o plasmídeo de tipo selvagem repleta C. trachomatis L2 (434/bu) (figura 2A), nem o plasmídeo sem plasmídeo Não transformado L2R (figura 2B), expressos em GFP. Consistente com os resultados estabelecidos da síntese de glicogénio em C. trachomatis requer seu plasmídeo, coloração de iodo mostrou que o glicogênio foi acumulado nas inclusões de tipo selvagem L2 (figura 2A), mas não as de L2R (figura 2B). Na presença de 5 µg/ml de ampicilina, que inibe a divisão RB, o L2R Não transformado (figura 2C) formou inclusões contendo RBs gigantes sem produzir glicogénio; enquanto o cloranfenicol (concentração final: 0, 5 µg/ml) inibiu completamente a formação de inclusões visíveis nas células infectadas L2R (figura 2D). Consistente com os dados publicados por Wang et al. , pGFP::O L2R transformado por SW2 selecionado com ampicilina formou inclusões GFP positivas com glicogênio (figura 2E). pGFP:: L2R transformado SW2 selecionado com cloranfenicol também formou inclusões GFP positivas contendo glicogênio (figura 2F). Como esperado, ampicilina-selecionado transformants foram capazes de formar tamanho normal, GFP-positivo, glicogênio contendo inclusões na presença de cloranfenicol (Figura 2G); da mesma forma, o cloranfenicol-selecionado transformants foram completamente resistente à ampicilina, expressa GFP e produzidos de glicogênio (Figura 2H). Estes resultados sugerem que o gene do gato no pGFP::O plasmídeo SW2 é funcional em clamidiae, e a resistência ao cloranfenicol pode ser usada como marcador de seleção para transformação clamidiosa.
Inclusion, GFP expression and glycogen synthesis of pGFP:: SW2 transformants of C. trachomatis L2. Não plasmídeo-se repleta de tensão 434/bu (Um), untranformed plasmídeo livre de tensão L2R (B-D), e transformou L2R selecionado com ampicilina (E, G) ou cloranfenicol (F, H) foram cultivadas com o meio contendo um antibiótico indicado ou com antibiótico livre médio. Imagens de inclusões em culturas não manchadas e manchadas de iodo foram adquiridas com microscopia de contraste de fase ou microscopia de fluorescência 48 horas após a inoculação. Em todos os painéis, contraste de fase e imagens GFP são superimpossíveis.
a seguir removemos o gene da β-lactamase do pGFP.::O plasmídeo SW2 descrito na secção “métodos”, e utilizado o pGFP-gato resultante::plasmídeo SW2 para transformar L2R. clamidiae transformadas foram submetidas a selecção com cloranfenicol utilizando o mesmo regime descrito acima. Inclusões resistentes ao cloranfenicol surgiram em cerca de 20% das células infectadas na cultura da passagem 4. Microscopia de fluorescência e coloração de iodo revelaram inclusões GFP e glicogênio positivos em células que foram infectadas com EBs colhidos da passagem 5, e cultivadas na presença de cloranfenicol (Figura 3, Painel superior). No entanto, como resultado de uma falta de β-lactamases em pGFP-GATO::SW2 plasmídeo, o transformants não foram capazes de formar normal inclusões na presença de ampicilina; em vez disso, suas inclusões foram preenchidos com aberrantes RBs. Embora as inclusões irregulares ainda fossem positivas para o GFP, eles estavam em grande parte livres de glicogênio (Figura 3, Painel inferior). Após a passagem 5, o PGFP-CAT::: os transformadores SW2 foram cultivados com 0, 5 µg/ml de cloranfenicol para quatro passagens adicionais a uma razão de separação de 1:100 para cada passagem. Todas as inclusões na passagem 9 tinha a mesma aparência que as inclusões do plasmídeo-se repleta chlamydiae, e não do plasmídeo livre L2R, e todos foram encontrados para expressar GFP (dados não mostrados). Estes resultados provam que o gene CAT no pGFP-gato::plasmídeo SW2, semelhante ao pgfp::plasmídeo SW2, funciona como marcador de selecção para a transformação de C. trachomatis.
inclusão, expressão de GFP e síntese de glicogénio no L2R transformado com pGFP-CAT::SW2. As células infectadas com transformadores seleccionados com cloranfenicol foram expostas a cloranfenicol ou ampicilina. Imagens de inclusões em culturas não manchadas e manchadas de iodo foram adquiridas com microscopia de contraste de fase ou microscopia de fluorescência 48 horas após a inoculação. Contraste de fase e imagens GFP são superimposíveis.
note-se que Tam et al. anteriormente tentou desenvolver um sistema de transformação com o gene CAT como marcador selectivo . Nesse estudo, um vetor de vaivém contendo um gene CAT foi eletroporado em EBs de C. trachomatis e (estirpe UW-5/CX) e L2 (estirpe 434/Bu). Embora tanto o mRNA CAT como a actividade enzimática fossem detectáveis nas culturas iniciais de chlamydiae transformada, os autores não conseguiram obter transformadores estáveis após selecção com cloranfenicol por 4 passagens. É importante notar que ambas as estirpes electroporadas contêm um plasmídeo nativo que partilha a mesma origem de replicação com o plasmídeo recombinante utilizado para transformação . Desde Wang et al. foram capazes de obter transformadores estáveis resistentes à penicilina apenas a partir de L2R, um C isento de plasmídeos. trachomatis L2 variant, but not the wild-type, plasmid-replete 434 / Bu , under otherwise identical experimental settings, it is retrospectively not surprising that Tam et al. failed to deriving stable chlamydiae resistant chloramphenicol.
