cis–trans isomerase de ácidos graxos insaturados em Pseudomonas e Vibrio: Bioquímica, Biologia molecular e função fisiológica de um mecanismo único adaptador ao stress

Abstract

isomerização de cis a ácidos gordos trans insaturados é um mecanismo que permite que bactérias Gram-negativas pertencentes aos géneros Pseudomonas e Vibrio se adaptem a várias formas de stress ambiental. A extensão da isomerização parece correlacionar-se com os efeitos de fluidez causados, isto é, por um aumento da temperatura ou da acumulação de compostos orgânicos tóxicos na membrana. Ácidos gordos Trans são gerados pela isomerização direta da respectiva configuração cis da dupla ligação sem um deslocamento de sua posição. A conversão de ácidos gordos cis insaturados para trans é aparentemente instrumental na adaptação da fluidez da membrana à mudança de parâmetros químicos ou físicos do ambiente celular. Este mecanismo adaptativo parece ser uma forma alternativa de regular a fluidez da membrana quando o crescimento é inibido, por exemplo, por concentrações elevadas de substâncias tóxicas. A atividade da isomerase cis–trans (Cti) está constitutivamente presente e está localizada no periplasma, não requer ATP nem qualquer outro cofactor como NAD(P)H ou glutationa, e opera na ausência de síntese de novo de lípidos. Sua independência da ATP está de acordo com a energia livre negativa da reação. a cti codifica um polipéptido com uma sequência de sinal hidrofóbico N-terminal, que é clivada durante ou pouco depois da enzima ser transportada através da membrana citoplasmática para o espaço periplásmico. Um local funcional de ligação heme do tipo C do citocromo foi identificado no polipéptido Cti previsto e muito recentemente, foi obtida evidência directa de que a isomerização não inclui uma saturação transitória da ligação dupla.Introdução-História

em todas as células vivas, o stress devido a alterações rigorosas no ambiente afecta as membranas. Como resultado da perturbação da integridade da membrana ocorre e, portanto, a função como uma barreira, como uma matriz para enzimas e como um transdutor de energia é comprometida . Se não forem tomadas contramedidas, pode ocorrer inibição do crescimento ou mesmo morte celular. A principal resposta adaptativa das células é manter a fluidez das suas membranas a um valor constante, independentemente das condições ambientais reais. Esta estabilização da fluidez da membrana, conhecida como “adaptação homeoviscosa”, é provocada por alterações na composição de ácidos gordos dos lípidos de membrana, constitui a resposta predominante das bactérias às substâncias activas pela membrana ou a alteração das condições ambientais . Este mecanismo fundamental foi investigado e relatado no famoso trabalho de Ingram no final dos anos 70 do século passado . No entanto, até o final dos anos 80, a configuração cis da dupla ligação ainda era considerada a única que ocorre naturalmente em ácidos gordos bacterianos. A melhoria da analítico de corte técnicas, especialmente através da introdução de colunas capilares em cromatografia gasosa facilitada clara diferenciação de relacionados ésteres metílicos de ácidos graxos e uma nova classe de ácidos graxos, i.e. trans configurado ácidos graxos insaturados, foi encontrado em alguns procariotas . Os primeiros relatórios de isómeros trans de ácidos gordos insaturados foram para Vibrio e Pseudomonas há apenas 10 anos. Poderia então demonstrar-se que os ácidos gordos insaturados trans foram sintetizados in vivo a partir de acetato na Pseudomonas atlantica, embora, com base em vias biossintéticas conhecidas de ácidos gordos insaturados, não houvesse explicação possível de como tais ácidos gordos poderiam ser formados.

pouco tempo após ter sido demonstrado que a conversão de ácidos gordos cis em ácidos gordos insaturados trans constitui um novo mecanismo adaptativo que permite às bactérias alterar a sua fluidez da membrana em duas espécies, isto é, na bactéria psicrofílica Vibrio sp. estirpe ABE – 1 em resposta a um aumento da temperatura e na Pseudomonas putida P8 como adaptação a compostos orgânicos tóxicos, tais como fenóis .

a nossa mini-revisão resume o conhecimento actual e o progresso quanto ao estado do assunto, colocando a ênfase num mecanismo bastante eficiente e elegante que permite que as bactérias se adaptem às mudanças ambientais que afectam a fluidez da membrana.

2 fisiologia e função da isomerase cis–trans (Cti) de ácidos gordos insaturados

ambos, em Vibrio sp. estirpe ABE-1 e in P. putida P8, observa-se um aumento claro da quantidade normalmente baixa de ácidos gordos trans insaturados quando as células são expostas a temperaturas elevadas ou concentrações tóxicas de fenol. As células em crescimento de P. putida reagem ao fenol de forma dependente da concentração, ou seja, o aumento da diminuição trans e simultânea dos respectivos ácidos gordos cis insaturados correlaciona-se com a quantidade de fenol acumulada na membrana . Tal conversão não depende do crescimento, pois também ocorre em células não-crescentes nas quais a razão entre ácidos gordos saturados e insaturados e a quantidade total de ácidos gordos insaturados não pode ser alterada devido à falta de biossíntese lipídica . Consistentemente, a reação ocorre em células nas quais a biossíntese de ácidos graxos é inibida pela cerulenina . A conversão Cis-trans tem uma cinética enzimática e atinge a sua razão trans-cis final 30 minutos após a adição dos agentes tóxicos da membrana. Como a taxa de conversão não é afetada pelo cloranfenicol, concluiu-se que o sistema está constitucionalmente presente e não requer biossíntese da proteína de novo .

ácido oleico (C18:1Δ9cis), que normalmente não é sintetizado por P. putida P8, é, no entanto, incorporado em lípidos de membrana em culturas completadas. Após a adição de uma concentração tóxica de ácido oleico de 4-clorofenol foi convertido em seu isômero trans, ou seja, ácido elaídico (C18:1Δ9trans). Tal constatação evidenciou que os ácidos gordos trans são sintetizados por isomerização direta de ácidos gordos cis para ácidos gordos insaturados trans sem mudar a posição da ligação dupla . O aumento dos ácidos gordos insaturados trans foi acompanhado pela diminuição dos respectivos ácidos gordos insaturados cis, enquanto a quantidade total de ambos foi mantida constante a qualquer concentração de toxinas adicionadas . O sistema não requer ATP ou qualquer outro cofactor como NAD(P)H ou glutationa. A sua independência em relação à energia que fornece ATP está de acordo com a energia livre negativa da cis para a reacção trans .

todos estes dados levaram à proposição de que a isomerização cis-trans é uma nova resposta adaptativa em bactérias que lhes permite lidar com o aumento da temperatura ou concentrações tóxicas de compostos perturbadores da membrana, condições que de outra forma influenciariam a sua fluidez da membrana .

o benefício da conversão provém das diferenças estéricas apresentadas pelos ácidos gordos cis e trans insaturados. Um alto teor de ácidos graxos saturados em membranas permite que as cadeias acilo de ácidos graxos formem uma interação hidrofóbica ótima entre si, eventualmente levando a uma membrana rígida e bem embalada. Em geral, os ácidos gordos saturados têm uma temperatura de transição ou um ponto de fusão muito mais elevados quando comparados com os ácidos gordos insaturados cis. Os fosfolípidos que contêm ácidos gordos saturados de 16: 0 têm uma temperatura de transição cerca de 63 ° C superior à dos ácidos gordos insaturados de 16:1 cis . A temperatura de transição de fase das membranas aumenta com proporções crescentes de ácidos graxos saturados a insaturados. A ligação dupla de um ácido gordo cis insaturado provoca uma curva incovível com um ângulo de 30° na cadeia acila. Consequentemente, o pacote altamente ordenado de cadeias de acil nas membranas é perturbado, o que, por sua vez, resulta em temperaturas de transição de fase mais baixas de tais membranas . Assim, os ácidos graxos insaturados na configuração cis com estruturas estéricas retidas (isto é, um acinco na cadeia acila) resultam em uma membrana com uma fluidez relativamente elevada. Em contraste marcado, a estrutura estérica estendida longa da configuração trans não tem o kink e é capaz de inserir na membrana similarmente aos ácidos graxos saturados .

as bactérias adaptam-se a um aumento da fluidez da membrana aumentando o grau de saturação dos seus ácidos gordos fosfolípidos e, em alguns casos, mudando de cis para trans a configuração dos seus ácidos gordos insaturados. . Uma grande desvantagem de mudanças no grau de saturação como uma resposta de estresse se origina de sua estrita dependência do crescimento celular e biossíntese de ácidos graxos. Consequentemente, as bactérias que utilizam este mecanismo não são capazes de efectuar modificações pós-biossintéticas da sua fluidez da membrana. Com efeito, observou-se que os solventes provocam uma alteração na relação entre ácidos gordos saturados e insaturados apenas até concentrações que inibem completamente o crescimento. Na presença de concentrações mais elevadas, isto é, tóxicas, as células não podem reagir e, portanto, não podem adaptar-se a essas condições ou mesmo morrer . A isomerização dos ácidos gordos cis em ácidos gordos insaturados trans encontrados até agora apenas em estirpes dos géneros Pseudomonas, incluindo os principais representantes P. putida e P. aeruginosa, e Vibrio representam uma solução para o problema da dependência do crescimento, uma vez que também funciona em células não em crescimento. Embora a mudança do cis para a dupla ligação trans insaturada não tenha o mesmo efeito decrescente na fluidez da membrana como uma conversão para ácidos gordos saturados, ainda causa um efeito substancial na rigidez da membrana .

após as primeiras observações baseadas principalmente em compostos fenólicos, uma série de solventes orgânicos foi testada para a sua capacidade de ativar Cti, qualitativa e quantitativamente. Assim, o grau de isomerização parece correlacionar-se com a toxicidade e a concentração de compostos orgânicos na membrana . A acção antimicrobiana de um solvente correlaciona-se com a sua hidrofobicidade de uma forma expressa pelo logaritmo do coeficiente de partição do composto numa mistura de n-octanol e água (logPow) . Solventes orgânicos com um logPow entre 1 e 5 são altamente tóxicos para microorganismos porque se dividem preferencialmente em membranas, onde causam um aumento na fluidez da membrana, levando finalmente a permeabilização não específica . A relação entre o valor logP de um composto e a sua toxicidade é apresentada no quadro 1, no qual 11 compostos investigados são listados de acordo com os seus valores logP crescentes. Em Fig. 1 Os valores logP são traçados em função das concentrações estimadas medidas que causam uma inibição do crescimento de 50% (CE 50) e, simultaneamente, as concentrações dos compostos que causam um aumento de meio-máximo na razão trans/cis (TC 50) das bactérias. Assim, há uma relação direta entre a toxicidade dos solventes orgânicos e seus efeitos de ativação sobre o Cti, no entanto, isso é completamente independente das estruturas químicas dos compostos.

desde 1989, quando foi descoberta uma estirpe P. putida que cresceu em meios contendo uma segunda fase do tolueno, estireno ou xileno, geralmente altamente tóxico, vários outros P. estirpes de putida foram encontradas com propriedades semelhantes, e muitos grupos de pesquisa tentaram descobrir os mecanismos subjacentes à tolerância do solvente. Na maioria destas bactérias, a Cti esteve envolvida na tolerância ao solvente.

não só os solventes orgânicos ou o aumento da temperatura, mas também alguns outros elitores de stress foram testados quanto ao seu efeito sobre a Cti. Em resumo, todas as membranas que afetam estímulos como solventes orgânicos, estresse osmótico (causado por NaCl e sacarose), metais pesados, choque térmico e antibióticos membranares ativos foram mostrados para ativar o sistema . No entanto, as condições de estresse, tais como o estresse osmótico causado pelo glicerol, choque frio e alto pH, que são conhecidos por não serem ativadores do K+celular-absorção — a primeira reação celular à lesão da membrana levando ao aumento da permeabilização — não causaram a ativação do Cti . Estes resultados indicam claramente que a razão cis/trans é presumivelmente parte de um mecanismo geral de resposta a stress de microrganismos .

3 Bioquímica e Biologia molecular do ITC

após a descrição fisiológica da função global do ITC nas bactérias para se adaptarem a diferentes tensões, foram realizadas investigações biológicas e bioquímicas moleculares para caracterizar este sistema de resposta adaptativa único.A membrana citoplasmática foi considerada como a localização da enzima onde também estão presentes os seus substratos, os ácidos gordos fosfolípidos. Surpreendentemente, no entanto, a Cti foi então purificada a partir da fracção periplásmica de Pseudomonas oleovorans e Pseudomonas sp. estirpe e-3 . A clonagem da enzima permitiu o seu isolamento como uma proteína heteróloga de P. putida P8, expressa em Escherichia coli. A Cti é uma proteína neutra de 87 kDa e mostrou ser monocistronicamente transcrita e constitucionalmente expressa. The nucleotide sequence of the cti gene from P. putida P8, P. putida DOT-T1E and P. oleovorans Gpo12 finalmente tornou evidente que a isomerase possui uma sequência de sinal hidrofóbico N-terminal, que é clivada após direcionar a enzima para o espaço periplásmico.

um mutante knockout cti de P. putida DOT-T1E foi construído que é incapaz de isomerizar ácidos gordos insaturados cis. Este mutante tem uma taxa de sobrevivência quando chocado com 0.08% (vol/vol) de tolueno inferior à estirpe do tipo selvagem , e apresenta também uma fase de latência mais longa do que a estirpe parental quando cultivada com tolueno fornecido na fase gasosa, resultados que implicam claramente a ITC na resposta do tolueno nesta estirpe. No entanto, é pouco provável que a isomerização cis–trans seja o único mecanismo de adaptação necessário para solventes orgânicos, porque são conhecidas estirpes que podem realizar a isomerização e ainda são sensíveis ao solvente .

Holtwick et al. forneceu provas de que a enzima é uma proteína do tipo C do citocromo, uma vez que podiam encontrar um local de ligação heme no polipéptido Cti previsto. Para uma preparação enzimática de Pseudomonas sp. estirpe e-3, que é presumivelmente homóloga do produto do gene cti de P. putida P8, foi sugerido que o ferro (provavelmente Fe3+) desempenha um papel crucial na reação catalítica . Verificou–se que a isomerização Cis-trans é independente da cardiolipina sintetase, uma enzima que facilita a adaptação a longo prazo da membrana através da síntese aumentada de cardiolipina .Muito recentemente, o mecanismo molecular da reacção de isomerização foi elucidado. Na suplementação experimentos com duplo deuterated ácido oleico foi demonstrado que o ácido oléico foi convertida exclusivamente em dobro deuterated elaidic ácido após a ativação do Cti. Deve ser excluída uma saturação transitória da ligação dupla durante a isomerização, bem como uma reacção de hidratação acoplada–desidratação . Assim, propõe-se um mecanismo enzimático: um complexo de substrato enzimático é formado no qual o ferro eletrofílico (provavelmente Fe3+), fornecido pelo domínio heme presente na enzima, remove um elétron da ligação dupla cis, transferindo o sp2 ligando-se a um sp3. A ligação dupla é então reconstituída após rotação para a configuração trans. Um esquema deste mecanismo enzimático proposto é apresentado na Fig. 2. Tal mecanismo está de acordo com as experiências de mutagénese no local realizadas para destruir o motivo de ligação heme no ITC de P. putida P8 . Estas mutações resultam em perda de função da enzima e, assim, fornecem evidência para a presença do citocromo C e heme no centro catalítico da enzima. Uma vez que a reacção da enzima não depende de uma actividade do co-factor Cti difere de todas as outras enzimas conhecidas contendo heme que actuam em ácidos gordos como substratos. Não há, no entanto, necessidade de um cofactor porque não se consome energia elétrica líquida.

outra indicação para a sua singularidade deriva de pesquisas de similaridade: a Cti não mostrou semelhanças significativas com peptídeos homólogos quando a sequência de aminoácidos prevista foi comparada com outras proteínas. Não surpreendentemente, no entanto, a comparação das sequências de aminoácidos das sete até as atuais proteínas Cti conhecidas identificou todas elas como polipeptídeos contendo heme do tipo C citocrom . Independentemente do táxon, um grupo heme do citocromo tipo c, é apresentar como altamente conservado motivo e como um funcional de domínio em todas as enzimas comparada , em particular, a heme-binding site em Cyt c proteínas está localizado entre o heme-vinil grupos e os dois cysteines encontrado no conservada heme-binding motivo CXXCH.

em todas as sequências Cti das seis estirpes de Pseudomonas investigadas até agora está presente uma sequência de sinal N-terminal, indicativa da localização periplásmica do Cti. Tal localização já foi comprovada para P. oleovorans e P. putida DOT-T1E . No entanto, uma característica do peptídeo sinal para sec-secreção dependente não está presente na proteína Cti de V. cholerae. Vários alinhamentos de sequências das sete proteínas Cti conhecidas revelaram que as proteínas de Pseudomonas e de Vibrio formam uma árvore filogenética composta de três ramos principais, sugerindo um ancestral comum da enzima. Curiosamente, o polipeptídeo previsto de V. cholerae obviamente não constitui um grupo separado, mas emana do grupo diverso de proteínas de P. aeruginosa e P. sp. E-3 . Muito recentemente, estudos de alinhamento revelaram que genes familiares ao cti também podem estar presentes nos genomas de bactérias pertencentes aos géneros Metilococcus e Nitrosomonas. Estes organismos também são conhecidos por conter ácidos gordos insaturados trans . No entanto, a evidência fisiológica ou bioquímica direta para a presença de Cti nestas bactérias ainda está faltando.

4 regulação da Cti

uma das principais questões em aberto relativamente à Cti dos ácidos gordos insaturados é a forma como a actividade desta enzima periplásmica expressa constitucionalmente é regulada. Uma possibilidade seria um modelo complexo no qual os substratos da enzima, os ácidos gordos cis insaturados, são clivados da fase periplásmica da membrana fosfolípidos. O ácido gordo insaturado livre resultante seria então isomerizado pela ação do Cti e posteriormente re-ligado ao lisofosfolípido, resultando em um ácido gordo fosfolípido contendo ácidos gordos insaturados trans . No entanto, um modelo tão complexo não está de acordo com os dados que confirmam a atividade da Cti nas células em repouso e na completa ausência de fontes de energia , já que, pelo menos, o reatachment dos ácidos graxos modificados para a membrana necessitaria de energia.

a regulação da actividade enzimática pode, no entanto, ser realizada simplesmente dando ao centro activo da enzima a capacidade de atingir o seu substrato, a dupla ligação, que por sua vez depende do Estado de fluidez da membrana. Consequentemente, a regio-especificidade observada da enzima reflecte a penetração do local activo da isomerase a uma profundidade específica na membrana . A estrutura hidrofílica da Cti e a sua localização periplásmica suportam a presunção de que a enzima só pode atingir o seu alvo, ou seja: as ligações duplas de ácidos gordos insaturados que se encontram numa determinada profundidade da membrana, quando a membrana é “aberta” por condições ambientais que causam a desintegração da membrana . Foi anteriormente demonstrado que uma diminuição na ordem da cadeia acil pode resultar num aumento da penetração e translocação de proteínas nas membranas . Por analogia com certas fosfolipases, é concebível que a Cti apresente uma penetração mais profunda na membrana quando a ordem das cadeias de acil é diminuída e o espaçamento dos grupos de cabeça fosfolípidos é aumentado. Também é claramente concebível que a diminuição da embalagem das membranas permitiria que ligações duplas abordassem as superfícies da membrana com mais frequência , facilitando, em última análise, a interação com a isomerase . Como acyl cadeia de embalagem é aumentado pelo cis para trans isomerização dos ácidos graxos insaturados , a penetração da proteína poderia ser contrariada e, concomitantemente, o cis para trans isomerização inibida, eventualmente resultando em apertada regulamento do acyl cadeia de embalagem sem o envolvimento indireto de sinalização mecanismos e caminhos. Após a remoção do composto ativo da membrana, a recuperação da relação trans-cis regularmente baixa ocorre muito provavelmente pela síntese de novo normal de ácidos gordos all-cis, uma vez que o processo inverso (trans-cis) exigiria uma entrada de energia.

tal modelo para a regulação da actividade Cti também explica suficientemente a relação frequentemente relatada entre o grau de isomerização cis–trans e a toxicidade causada por uma determinada concentração de um factor de stress ambiental . Como outro resultado da reação catalisada pela enzima, ocorre uma redução da fluidez da membrana e, como a enzima não consegue atingir o seu alvo quando a fluidez da membrana atinge o seu nível normal, a enzima é forçada a sair da camada intermédia .

5 observações finais

embora a isomerização cis–trans dos ácidos gordos insaturados não tenha sido completamente compreendida, tornou-se óbvio que faz parte de um sistema geral de resposta ao stress nas células de Pseudomonas e Vibrio. Outra indicação para a função geral da Cti é também a sua dependência frequentemente descrita da indução/activação de outros mecanismos de resposta a stress .Evidentemente, constitui um mecanismo de adaptação urgente que permite modificações rápidas das membranas para lidar com o stress ambiental emergente. Uma resposta tão rápida, agindo em termos de minutos, dá tempo a outros mecanismos dependendo do crescimento celular para facilitar o seu papel na resposta adaptativa, uma vez que a reação imediata garante a sobrevivência em várias condições de estresse. No que diz respeito à tolerância com solventes, uma espécie de cascata de mecanismos rápidos (urgentes), a médio e a longo prazo, evidentemente, trabalham em conjunto para alcançar uma plena adaptação ao stress ambiental. O Cti representa, sem dúvida, um dos principais sistemas urgentes que ajudam as células a suportar o primeiro choque de tolueno, permitindo eventualmente ativação e indução de mecanismos adaptativos adicionais que finalmente provocam a adaptação completa .

devido à sua função e eficácia fáceis e porque funciona sem regulamentos complexos, é espantoso que tal mecanismo de isomerização cis a trans não esteja ubiquitosamente presente em bactérias Gram-negativas. Uma possível explicação pode vir da ocorrência generalizada dos dois gêneros Pseudomonas e Vibrio. Entre as bactérias não especializadas, os membros do gênero Pseudomonas são conhecidos por serem microorganismos altamente adaptáveis, tendo conquistado todos os nichos de um grande número de ecossistemas compreendendo Solo, pele humana e água do mar. Membros do gênero Vibrio também conquistaram uma grande variedade de ecossistemas, incluindo solos e mar profundo. Para serem capazes de colonizar todos esses nichos, eles precisam ser extremamente flexíveis e adaptáveis às condições ambientais em mudança. A Cti fornece às células um mecanismo eficaz para alcançar tal adaptabilidade. Isto não é necessário em outras bactérias Gram-negativas, tais como E. coli, que são especializadas em relação à vida no trato gastrointestinal dos mamíferos, onde eles podem viver felizes sem um mecanismo de adaptação de membrana urgente.Os lípidos de membrana oferecem uma ferramenta promissora como biomarcadores para a análise de mudanças microbianas na população. Na verdade, Guckert et al. sugeriram usar uma razão trans / cis superior a 0,1 (índice normal relatado para a maioria das amostras ambientais) como um índice de fome ou estresse. Como a medição dos perfis de ácidos graxos se tornou um método de rotina em muitos laboratórios, isso soa como uma abordagem promissora para a avaliação dos efeitos tóxicos. A determinação do Índice trans/cis pode, portanto, ser uma opção valiosa para estudar o estado de toxicidade das amostras naturais, especialmente quando não podem ser realizados testes dependentes do crescimento, por exemplo, em habitats naturais. O principal campo de aplicação desse indicador parece ser a medição da toxicidade e do stress ambiental durante os processos de biorremediação in situ, em que os perfis de ácidos gordos têm importância como marcador para as investigações ecológicas da microflora do solo. Por exemplo, durante a biorremediação de locais poluídos, o nível de ácidos gordos insaturados trans pode ser utilizado como marcador para o stress geral e a redução do stress para monitorizar o processo de biodegradação . A aplicação da isomerização cis–trans como uma ferramenta de avaliação para a toxicidade geral de compostos orgânicos já foi descrita para compostos carbonílicos aromáticos . Estudos adicionais visando e melhorando a utilização da isomerização de ácidos gordos cis para ácidos gordos trans insaturados como um indicador de stress são vitais e podem resultar em uma técnica aplicável para a monitorização ambiental.