Cistron

Biogênese de PTX

Os cinco PTX subunidades são codificados por contíguos cistrons dentro de um único polycistronic operon , cuja expressão é regulada pela BvgA/S do sistema. Através desta produção de toxina do sistema de dois componentes pode ser modulada pela presença de MgSO4 ou ácido nicotínico, ou durante o crescimento a baixas temperaturas (para revisão, ver ). BvgS é uma proteína de extensão interna de membrana expressando múltiplas atividades cinase. No estado activo, activa o BvgA por fosforilação. O bvga fosforilado, um regulador citoplasmático de transcrição, liga-se então aos locais do operador da região promotora do gene PTX, onde interage com a ARN polimerase e activa a transcrição. Embora moduladores interferindo com a sinalização BvgS tenham sido identificados, nenhum ligando BvgS necessário para desencadear a sinalização é conhecido, sugerindo que BvgS é ativado por padrão .

após a transcrição, as subunidades individuais são produzidas como preproteinas contendo peptídeos de sinal clivable. Após a translocação através da membrana interna (provavelmente através de uma via dependente de Sec), os peptídeos do sinal são removidos. Embora os peptídeos de sinal mostrem características típicas dos substratos para a líder peptidase I, a sua clivagem pelo líder de Escherichia coli peptidase I é muito ineficiente. A co-expressão do gene lep de B. pertussis em E. coli aumenta substancialmente a maturação das subunidades PTX . Dentro do espaço periplásmico, formam-se ligações dissulfureto intra-subunidades, e a holotoxina é então montada antes da secreção através da membrana externa. O PTX contém um total de 11 ligações de dissulfureto intra-subunidades, uma em S1, duas em cada S4 e S5, e três em cada S2 e S3 . Todas as cisteínas presentes no PTX estão envolvidas em ligações de dissulfureto intra-cadeia . A formação de dissulfeto é importante para a biogénese da toxina, uma vez que a alteração de qualquer cisteína em S1 impede esta subunidade de se reunir com o oligómero B. A formação adequada de dissulfureto depende do sistema DsbA/DsbC, que foi considerado essencial para a montagem e secreção de PTX . No entanto, as mutações no dsbC, que codificam uma das três isomerases de dissulfureto, não têm aparentemente qualquer efeito sobre a montagem da toxina, embora prejudiquem a sua secreção, sugerindo que o DsbC actua sobre um componente que é especificamente necessário para a secreção de PTX.A secreção

não é necessária para as atividades biológicas do PTX, mas a montagem completa da holotoxina é importante para uma secreção eficiente, uma vez que estirpes projetadas para produzir apenas S1 ou apenas o oligómero B apresentam um defeito na secreção . No entanto, um oligômero B totalmente funcional pode ser secretado a um certo grau na ausência de S1, indicando que a presença de S1 não é um requisito absoluto para a secreção de oligômeros B. Em contraste, S1 sozinho não pode ser secretado na ausência do oligômero B, sugerindo que os determinantes da secreção estão localizados dentro do oligômero B, embora a presença de S1 pode certamente aumentar a eficiência da secreção. Certas mutações no gene S1 têm um forte efeito deletério na secreção, particularmente na área em torno de Arg-57 , sugerindo que esta região de S1 desempenha um papel na secreção de PTX. Na ausência do oligômero B, s1 provavelmente partições para a membrana externa, talvez através de seu C-terminal, domínio hidrofóbico. Este pode ser o local de montagem com o oligómero B antes da secreção através da membrana exterior .

os passos moleculares na montagem da holotoxina ainda são pouco compreendidos. As subunidades únicas em estirpes mutantes que não produzem as outras subunidades degradam-se rapidamente. Certas combinações de subunidades parecem se estabilizar mutuamente . Por exemplo, a estabilidade da subunidade S2 é grandemente aumentada pela presença de S4 e vice–versa, que é consistente com a formação dímero S2-S4 revelada pela estrutura cristalina da holotoxina. Também é possível que subconjuntos do dímero S2-S4 com a subunidade S1 sejam formados na ausência de S3 e S5. O dímero S2-S4 não foi secretado em B. pertussis, enquanto a adição de S1 a este dímero pode resultar em algum nível de secreção.

o transporte de PTX através da membrana exterior de B. pertussis depende de um sistema de secreção tipo IV (t4ss) composto de nove proteínas diferentes, chamado PtlA através de PtlI . Estas proteínas são homólogas às dos T4ss de outras bactérias, incluindo Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, e Rickettsia prowasekii . Os genes ptl situam-se directamente a jusante dos cinco genes PTX estruturais e estão sob o controlo do promotor ptx . No entanto, as proteínas Ptl parecem ser produzidas em níveis inferiores às subunidades PTX, como evidenciado por fusão translacional do gene phoA com vários genes ptx e ptl . A produção de certas proteínas Ptl parece ser um passo limitante na secreção de PTX. Durante o crescimento exponencial , estima-se que as bactérias secretam três moléculas de toxina/min/ célula bacteriana, e as subunidades acumulam-se no espaço periplásmico, tanto como subunidades individuais como montadas em holotoxinas. A acumulação de subunidades ocorre ao longo do crescimento exponencial, apesar de os níveis de certas proteínas Ptl aumentarem para entre 30 e 1000 moléculas por célula. Assim, a secreção em vez de produção ou montagem de toxinas pode ser limitante de taxa. Curiosamente, na ausência das proteínas Ptl, algumas subunidades, como o dímero S2–S4 na presença de S1, podem ser secretadas , embora a secreção da holotoxina dependa fortemente da presença das proteínas Ptl.Pensa-se que as proteínas Ptl formam um complexo que abrange tanto as membranas interior como as membranas exteriores , e todas elas (pelo menos PtlA-H) parecem ser necessárias para a secreção de toxinas, tal como investigado por mutações em cada gene ptl individual . Algumas das mutações introduzidas em Trans em estirpes de tipo selvagem ptl+ resultaram em um fenótipo dominante de secreção negativa, confirmando que pelo menos PtlC para PtlH são parte de um complexo multimérico. Um passo fundamental na secreção de PTX é, obviamente, a sua capacidade de atravessar a camada peptidoglicana, e a Pote demonstrou expressar a actividade da peptidogicanase . Esta proteína 276-resíduo-longa contém semelhanças no local activo com outras glicohidrolases, e as substituições de alanina neste local demonstraram diminuir significativamente a actividade da Peptidoglicanase da lla recombinante. As mesmas substituições no manto natural também abolem a secreção de PTX por B. pertussis, sugerindo fortemente que o pote é a peptidoglicanase necessária para que a toxina atravesse a camada de peptidoglicano.A secreção de PTX também requer energia . Duas das proteínas Ptl, PtlC e PtlH, contêm locais de ligação do trifosfato de adenosina putativo (ATP) e podem, assim, fornecer a energia necessária para a secreção da toxina. Ambas as proteínas têm demonstrado ser necessárias para a secreção , e em ambos os casos, os locais de ligação ATP putativo são essenciais para a função. Para ambos, um fenótipo negativo dominante é observado quando alelos mutantes são coexpressos com o alelo de tipo selvagem, sugerindo que ambos funcionam como multimers ou são parte do complexo de secreção. Demonstrou-se que o PtlH está associado à membrana interna, e as mutações no local de ligação ATP do PtlH afectam a sua localização celular e abolem as suas interacções com outras proteínas Ptl . O papel preciso do PtlC ainda não é conhecido. O PtlD é também uma proteína de membrana interna e contém cinco domínios transmembranares. É necessária para a estabilidade de PtlE, PtlF e PtlH através dos seus resíduos C-terminal 72. No entanto, esta região C-terminal não é suficiente para a secreção de toxinas . O PtlF apresenta características das proteínas da membrana exterior (OMPs), mas também pode estar associado à membrana interna. Em condições não redutoras, o PtlF e o PtlI migram como um complexo durante a electroforese em gel dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida, indicando que o PtlI se liga ao PtlF por formação de ligação dissulfureto . A formação adequada de ligação de dissulfureto entre PtlI e PtlF pode depender de DsbC, uma vez que as mutações no gene dsbC afetam a secreção sem afetar o conjunto da toxina .