Clastogenic atividade 2-chlorodeoxyadenosine em células somáticas de mamíferos

MUTAGENESIS
ARTIGO de PESQUISA

Clastogenic atividade 2-chlorodeoxyadenosine em células somáticas de mamíferos

Gilmara Ausech AntonucciI; Catarina Satie TakahashiI, II

IUniversidade de São Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Genética, Ribeirão Preto, SP, Brazil
IIUniversidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Departamento de Biologia, Ribeirão Preto, SP, Brazil

Correspondence

ABSTRACT

The base analogue 2-chlorodeoxyadenosine (2-CdA) used for therapy in chronic resistant and advanced lymphoproliferative disorders, is cytotoxic for both dividing and non-dividing lymphocytes. O presente trabalho avaliou o potencial clastogénico deste fármaco in vitro em linfócitos humanos em cultura e in vivo em células da medula óssea de ratinhos BALB/C. Nos linfócitos humanos, o efeito clastogénico do 2-CdA foi estudado nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, utilizando três concentrações diferentes (10, 20 e 40 mg/mL). Os endpoints analisados incluíram índice mitótico( em), índice de proliferação (PI), troca cromática irmã (SCE) e aberração cromossômica (CA). A análise estatística por um teste de variância (ANOVA) mostrou um aumento significativo (p < 0.05) nas frequências da CA para as células tratadas durante a fase S, mas o em não variou. As concentrações testadas não produziram um aumento significativo da frequência média de SCE, nem alteraram o IP celular nas fases G1 e S. As concentrações testadas in vivo foram de 0, 25, 0, 375 e 0, 5 mg/kg de peso corporal. Neste ensaio, não foram observadas alterações nas frequências de CA e em nos níveis posológicos testados. Assim, os resultados indicam um efeito clastogénico do 2-CdA em culturas de linfócitos humanos.

palavras-chave: linfócitos humanos, 2-CdA, aberrações cromossómicas, SCE, ciclo celular.Os análogos da purina são altamente activos no tratamento de doenças linfoproliferativas (Pott-Hoeck e Hiddemann, 1995). A cladribina, 2-clorodeoxiadenosina (2-CdA), é um análogo nucleosídeo com um átomo de halogéneo substituído na posição 2 do seu anel de purina, que confere resistência à desaminação pela adenosina deaminase (ada). 2-CdA é uma droga de escolha no tratamento da leucemia de células pilosas, mas também é altamente eficiente em outras doenças malignas linfóides de baixo grau, incluindo leucemia linfocítica crônica (LLC). Os relatórios na literatura demonstraram que o 2-CdA dá uma taxa de resposta completa (CR) e uma taxa de resposta global (ou) semelhantes à fludarabina, mas a influência de ambos os agentes nas taxas de sobrevivência dos doentes com LLC ainda é incerta. A taxa CR induzida pelo 2-CdA é significativamente mais elevada do que nos doentes tratados com quimioterapia convencional (Robak, 2001). 2-CdA é outro novo análogo quimioterapêutico da purina, com toxicidade específica para os linfócitos (Schrimer et al., 1997). A citotoxicidade ocorre em células proliferativas e Quiescentes, resultando em eventos como inibição do ADN e síntese proteica, bem como indução de apoptose (Robertsson et al., 1993). Apesar da toxicidade, bons resultados em resposta terapêutica foram obtidos, e esta droga é a principal opção no tratamento de tricoleukemia, onde os pacientes apresentam leucemia de células cabeludas (HCL) (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993).

os desoxinucleósidos de adenina induzem apoptose em linfócitos Quiescentes e são medicamentos úteis para o tratamento de doenças linfoproliferativas indolentes. Foram propostos vários mecanismos para explicar a toxicidade da desoxiadenosina e dos seus análogos em células Quiescentes, incluindo a ligação directa do dATP ao factor pró-apoptótico Apaf-1 e a activação das vias caspase-9 e -3 (Genini et al., 2000).

um doente com leucemia mielóide aguda tratado com 2-CdA e Ara-c apresentou recuperação da medula atrasada, sinusite e sépsis de Candida tropicalis. Ela desenvolveu falha de órgãos multisistemáticos e morreu um mês depois de iniciar a terapia com LMA. O exame Post mortem, limitado ao tórax e abdómen, revelou candidíase disseminada envolvendo pulmões, coração, fígado, rins e baço (Mathew et al., 2000).

Zwaan et al. (2002) observaram que pacientes com a t(9:11) parecia ser muito mais sensíveis do que outros pacientes com LMA para as seguintes drogas: cytarabine (mediana: 2.9-fold), doxorrubicina (4.5-fold), mitoxantrone (8.0-fold), 2-chlorodeoxyadenosine (10.0 vezes).

análogos de Nucleosido (NA) tais como citosina arabinosido, fludarabina, cladribina e gemcitabina são componentes essenciais da terapêutica de indução da LMA (leucemia mielóide aguda); são também eficientes no tratamento de perturbações linfoproliferativas e foram utilizados no tratamento de alguns tumores sólidos. Estes compostos importantes partilham algumas características comuns, nomeadamente em termos de necessidade de transporte por transportadores de membrana específicos, e metabolismo e interacção com alvos intracelulares. No entanto, diferem no que diz respeito aos tipos de transportadores e à sua interacção preferencial com determinados objectivos que podem explicar a eficácia contra tumores em rápida proliferação (Galmarini et al., 2001).

considerando esta informação, é importante avaliar o potencial clastogénico do 2-CdA, com base em notificações de que este fármaco induz citotoxicidade (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993) and DNA single-strand breaks (Liliemark and Juliusson, 1994). O objectivo deste estudo foi avaliar a capacidade deste agente quimioterapêutico na indução de lesões cromossómicas em linfócitos humanos e células da medula óssea de ratinhos BALB/C.

Materiais e Métodos

agente Químico

antitumoral 2-chlorodeoxyadenosine foi gentilmente cedido pelo Centro de Quimioterapia do Hospital de Clínicas da faculdade de Medicina de Ribeirão (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP) para o in vitro e in vivo de experiências.Foram obtidas amostras de sangue

linfócitos do sangue periférico humano

de seis voluntários saudáveis não fumadores (três mulheres e três homens), com idades entre 25 e 35 anos e submetidos ao tratamento durante as fases G1, S e G2 do ciclo celular, para análise de anomalias cromossómicas (CA) e índice mitótico (em). Além disso, linfócitos de três indivíduos (duas fêmeas e dois machos) foram utilizados para a análise da troca de cromatídeos irmãos (SCE) e do Índice de proliferação (PI). Os linfócitos foram cultivados em 78% do meio RPMI-1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA) suplementou com 20% de soro de vitelo fetal (Cultilab, Brasil) e adicionado com penicilina (5 mg/mL) e estreptomicina (10 mg/mL). As células foram estimuladas com 2% de fitohemaglutinina (Tecnologias da vida, Grand Island, NY). Para cada 5 mL de meio de cultura foi adicionado 1 mL de plasma e as culturas foram incubadas a 37 °C durante 52 h para análise da CA. As soluções 2-CdA foram diluídas em água desionizada nas seguintes concentrações: meio de cultura de 10, 20 e 40 mg/mL, de acordo com Preston et al. (1987). Um controle negativo foi incluído em todas as experiências. Preparação e coloração de lâminas foram realizadas por técnicas padrão (Moorhead et al., 1960). Lâminas para análise de permuta cromatídica irmã (SCE) e índice de proliferação (PI) foram obtidas de culturas paralelas às quais a 5-Bromo-2′-deoxiuridina (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA; 10 mg / mL) foi adicionado em adição ao 2-CdA. A coloração diferencial entre cromatídeos irmãos foi obtida pela técnica de fluorescência mais Giemsa, utilizando a Hoechst 33258 (Calbiochem – Behring Corp.; 0, 05 mg/mL Solução de Hank) e 5% Giemsa (Merck). Este método é uma modificação dos publicados por Korenberg e Freedlender (1974) e Perry e Wolff (1974). Os diapositivos foram expostos à luz branca durante a noite. As preparações de metafase com 46 ± 1 cromossomas foram analisadas em teste cego. Os cromossomas foram desenhados esquematicamente para a pontuação SCE, bem como para a análise CA.

protocolos de Tratamento

2-CdA tratamento de linfócitos culturas em diferentes fases do ciclo celular

aberrações Cromossômicas (Ac)

Depois de sete horas o início da cultura (fase G1), os linfócitos culturas foram tratadas com 2-CdA por 1 h a 37 °C em meio de cultura sem soro. As células foram fixadas 52 h após o início da cultura. Após tratamento com 2-CdA, as células foram lavadas duas vezes em meio isento de soro e reincubadas em meio completo. Para tratamento na fase S, 24 culturas h foram tratadas com 2-CdA durante 6 h. As células foram lavadas duas vezes em meio isento de soro, reincubadas em meio completo e fixadas após 52 h de incubação. No tratamento da G2fase, foram tratadas 69 culturas h com 2-CdA durante 3 h e as células foram fixadas após 72 h de incubação. A colchicina (Merck 0, 016%) foi adicionada 1, 5 h antes da fixação. Para determinar o em, 1000 células foram contadas por cultura, e 100 metafases de cada cultura foram analisadas para CA, totalizando 6000 células e 600 metafases, respectivamente, para cada tratamento.

Irmã chromatid trocas (Sce)

culturas de Linfócitos a partir de 4 de dadores saudáveis (duas fêmeas e dois machos) foram tratados com 5-BrdU (10 µg/mL) no início da incubação, e quando as células atingiram a fase G1 (7 h após o início da cultura), 2-CdA plus 5-BrdU foi adicionado por 1 h a 37 °C em meio de cultura sem soro. Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes em meio isento de soro, o 5-BrdU foi adicionado novamente e, em seguida, as células foram reincubadas em meio completo. Para tratamento na fase S, 24 culturas h foram tratadas com 2-CdA mais 5-BrdU em meio isento de soro durante 6 H. Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes em meio isento de soro e reincubadas em meio completo com 5-BrdU. Para a análise SCE e PI, as células (fases G1 e S) foram fixadas 72 h após o início da cultura. Cinqüenta segunda divisão metaphases por cultura foram marcados por SCE, e cem metaphases de cada cultura foram marcados para a primeira, segunda e terceira divisão celular, totalizando 200 metaphases e 400 células por tratamento, respectivamente. O PI foi obtido usando a seguinte equação:

PI =

onde M1 e M3 são os números das metafases de primeira e terceira divisão, respectivamente (Degrassi et al., 1989).

animais

os animais utilizados foram ratinhos BALB/c (Mus musculus), Obtidos da Casa Animal Da Escola de Medicina de Ribeirão Preto.

o ensaio In vivo em ratinhos Balb / c células da medula óssea

ratinhos com peso aproximado de 30 g (5-6 semanas) foi dividido em grupos de 8 animais (4 machos e 4 fêmeas) e tratados por injecção intraperitoneal com 0.5 mL/volume final da solução 2-CdA diluída com água destilada nas seguintes concentrações: 0, 25, 0, 375 e 0, 5 mg / kg de peso corporal. Vinte e duas horas após o tratamento (ou seja, duas horas antes do sacrifício), os ratos foram injectados com 0, 3 mL/volume final de uma solução de colchicina a 1% (Sigma) e mortos por inalação de Éter 2 h. O grupo de controlo negativo recebeu água destilada 0, 5 mL /volume final/animal e o grupo de controlo positivo recebeu ciclofosfamida (CP), 25 mg/kg de peso corporal. As preparações da medula óssea para células metafásicas foram obtidas pela técnica padrão (Ford e Hamerton, 1956). As lâminas foram analisadas num teste cego e 100 metafases por animal foram desenhadas esquematicamente. O em foi obtido contando o número de células mitóticas em 1000 células analisadas por animal, e 100 células foram marcadas para CA.

análise Estatística

análise de variância (ANOVA) foi realizada no número de anormal metaphases e o número total de CA, MI, Sce, e PI, com os cálculos dos valores de P para cada fase do ciclo celular. Sempre que p < 0.05 foi encontrado, os valores médios de cada tratamento foram comparados pelo teste Student-Newman Keuls. A análise estatística foi realizada usando os pacotes de software Sigma Stat (Jandel Corporation).Os resultados dos linfócitos humanos

foram tratados com diferentes concentrações (10, 20 e 40 mg/mL) de 2-CdA nas fases G1, S e G2 do ciclo celular. As aberrações cromossómicas (CA) e o índice mitótico (em) Foram analisados em linfócitos tratados de seis indivíduos saudáveis (três fêmeas e três machos) (Tabela 1). Para as células tratadas durante a fase S, foi observado um aumento significativo nas frequências da CA (p < 0, 05) em todas as concentrações, em comparação com as frequências de controlo. Os tipos mais comuns de aberração cromossômica observados foram lacunas cromatídicas e isocromátidas (dados não mostrados) e quebras, seguidas de dois minutos, fragmentos duplos e fragmentos únicos. Para as células tratadas durante as fases G1 e G2, as frequências da CA não mostraram qualquer diferença estatisticamente significativa entre as culturas tratadas e os valores de controlo. Embora tenha havido uma ligeira variação para o em, não foi observada uma diferença estatisticamente significativa (p < 0, 05) em nenhum dos tratamentos em relação aos índices de controlo.

as frequências médias da permuta cromatídica irmã (SCE) e do Índice de proliferação (PI) foram determinadas em quatro controlos e em culturas de linfócitos tratadas com 2-CdA durante as fases G1 e S em culturas colhidas após 72 h (quadro 2). As concentrações testadas (10, 20 e 40 mg/mL) não provocaram qualquer aumento significativo na frequência média de SCE, nem alteraram o IP celular durante as fases G1 e S (Quadro 2).

Balb/c de mouse da medula óssea do sistema

AC e a MI freqüências foram analisadas em células da medula óssea a partir de 8 Balb/c ratos (4 fêmeas e 4 machos) após tratamento intraperitoneal com 0,25, de 0,37 e 0,50 mg/kg b.w. 2-CdA (Tabela 3). No doseamento in vivo, o 2-CdA não demonstrou efeitos citotóxicos para nenhuma das doses testadas relativas às frequências da AC, bem como aos valores da IA, quando todos os grupos de tratamento foram comparados. A maioria das aberrações eram quebras cromatídicas. Não foi encontrada diferença significativa (p < 0,05) entre os animais ou entre machos e fêmeas para os parâmetros analisados.

discussão

nos últimos anos, vários estudos demonstraram o efeito antiproliferativo dos fármacos utilizados no tratamento de neoplasias linfóides. 2-CdA é um análogo base empregado na quimioterapia para um tipo particular de leucemia, a leucemia de células cabeludas. Existem também alguns dados que demonstram que o 2-CdA pode ser utilizado em associação com outros fármacos, no tratamento do linfoma não-Hodgkin refractário e recorrente de baixo grau (NHL) (Laurencet et al., 1999; Robak et al., 1999). No presente trabalho, foi realizado um estudo citogenético in vitro para avaliar o potencial clastogénico de 2-CdA em linfócitos humanos relativamente à indução de CA e SCE. De acordo com Moore e Bender (1993), CAs estrutural pode resultar em perda de material cromossômico. O tipo de CA formado depende da natureza da lesão induzida no DNA e na fase do ciclo celular durante a qual as células foram expostas (Natarajan et al., 1996).As culturas de linfócitos

foram tratadas com três concentrações de 2-CdA (10, 20 e 40 mg/mL) durante diferentes fases do ciclo celular. O efeito clastogénico do fármaco foi demonstrado pelo aumento significativo (p < 0, 05) nas frequências da AC para todas as concentrações testadas durante a fase S do ciclo celular. Para tratamento durante esta fase, o 2-CdA foi deixado durante 6 horas nas culturas. Para os agentes que actuam durante uma fase específica do ciclo celular, a sequência de administração pode determinar a eficácia e a toxicidade de uma terapêutica combinada (Smorenburg et al., 2001).

estes resultados são consistentes com os relatados por outros autores (Carson et al., 1983), sugerindo que o 2-CdA é incorporado no DNA produzindo quebras de cadeia única (SSBs). Os SSBs podem surgir diretamente, a partir da desintegração dos açúcares danificados, ou indiretamente, através da clivagem enzimática da coluna vertebral do fosfodiester. Os SSBs diretos surgem principalmente de um ataque por radicais livres, como espécies de oxigênio reativo, enquanto os SSBs indiretos são principalmente intermediários normais de reparação de excisão de base de DNA (RB). Os SSBs são também as lesões mais comuns induzidas por genotoxinas exógenas, tais como radiação ionizante, agentes alquilantes, e a topo1 camptetecina venenosa e seus derivados anticancerígenos (Caldecott, 2004).

alguns relatórios mostram que a base analógica precisa de um período de tempo mais longo para a fosforilação ocorrer (Gandhi et al., 1997). Este mecanismo pode explicar o aumento da frequência das aberrações cromossómicas totais durante a fase S do ciclo celular. O mesmo mecanismo ocorre em células tratadas com mitomicina C, um composto dependente de S, que requer replicação de DNA para converter danos de DNA em aberrações cromossômicas (Evans e Scott, 1964; Traganos et al., 1980). Outros agentes antitumorais representam o mesmo mecanismo e Acção do 2-CdA, tais como a fludarabina e 1-b-D-arabinosilcitosina (Ara-C).Os análogos nucleosidos citotóxicos têm uma ampla utilização clínica. Eles estavam entre os primeiros agentes quimioterapêuticos utilizados no tratamento de doenças malignas. Os nucleósidos anticancerígenos incluem análogos da pirimidina fisiológica e nucleósidos purina. Estes agentes actuam como antimetabolitos, competindo com nucleósidos naturais durante a síntese de ADN ou ARN e como inibidores das enzimas-chave das células (Szafraniec et al., 2004), São s-específicos, e devem ser fosforilados para ativar trifosfatos (Plunkett et al., 1980). Durante a fase S do ciclo celular, quando o material genético é duplicado pela máquina de replicação de DNA, as células são especialmente vulneráveis ao insulto genotóxico. Enquanto o G1 e o G2/M pontos de verificação prisão a progressão do ciclo celular, em pontos definidos através da inibição da cyclin-cinases dependentes, intra-S-fase de pontos de verificação são conhecidos por ocorrer a qualquer momento dentro da fase S e envolvem múltiplas vias de sinalização (Sidorova e Breeden, 2003; Andreassen et al., 2003)

é muito importante analisar o mecanismo de resposta ao fármaco durante diferentes fases do ciclo celular. O elevado nível de lesão cromossómica pode dever-se à citotoxicidade do 2-CdA causada pela sua conversão em 2-CdATP, o que induz a inibição da síntese e reparação do ADN, envolvendo as enzimas redutase ribonucleótida e polimerases do ADN. Este composto mostra resistência à atividade da adenosina deaminase (ada), que é conferida por um átomo de cloro e a substituição do hidrogênio na posição 2 do anel de purina adenosina (Baltz e Montello, 1993).

SCE são frequentemente considerados um parâmetro para avaliar a genotoxicidade, porque a sua frequência é claramente aumentada pela exposição a muitos produtos químicos mutagénicos e carcinogénicos. Na presente experiência, as frequências de SCE em culturas tratadas com 2-CdA apresentaram um ligeiro aumento em relação às culturas de controlo. O aumento observado durante ambas as fases não variou significativamente.Uma vez que muitos fármacos são activados após serem metabolizados, recomenda-se a realização de testes de mutagenicidade in vivo para avaliar a actividade clastogénica dos compostos que necessitam de activação metabólica. Tal abordagem também fornece condições semelhantes às encontradas em seres humanos (Legator e Ward Jr., 1991). Embora existam diferenças entre roedores e seres humanos, recomenda-se que qualquer avaliação se baseie tanto em estudos in vitro como in vivo, e não apenas em qualquer um deles (Huggett et al., 1996).

No presente estudo, o clastogenic efeito de 2-CdA foi, ainda, analisado em BALB/c ratos células da medula óssea em concentrações de 0,25, entre 0,375 e 0,5 mg/kg de peso corporal. Os resultados mostraram que o 2-CdA não foi eficiente para induzir aberrações cromossómicas. A falta de efeito in vivo pode ser devida à quantidade limitada de 2-CdA disponível, porque foi doada em condições diluídas. Foram notificados efeitos genotóxicos da gemcitabina analógica de base nas células da medula óssea do Ratinho, utilizando os sistemas de teste de micronúcleos e aberrações cromossómicas. Aydemir e Bilaloglu (2003) mostrou que a gemcitabine não induzir a qualquer significativas CAs e nem causar redução no MI por 6 h período de tratamento com doses de 2,0, 4,0 e 8.0 mg/kg b.w., comparado com o controle negativo; em contraste, a frequência total de CAs foi significativamente aumentada pela gemcitabina (p < 0, 0001) por um período de tratamento de 24 horas com as mesmas doses.Em conclusão, o 2-CdA demonstrou um efeito clastogénico em culturas de linfócitos humanos tratadas in vitro durante a fase S do ciclo celular, mas não foi observado efeito clastogénico significativo nas células tratadas durante as fases G1 e G2. No doseamento in vivo em ratinhos, o 2-CdA não demonstrou qualquer efeito clastogénico nos níveis de dose testados.

agradecimentos

estamos gratos ao Prof. Dr. A. T. Natarajan, Dr. Elza T. Sakamoto Hojo and Dr. Lusania G. Antunes for valuable comments on the manuscript and to Mr. Luiz Augusto da Costa Jr., Mr. Silvio A. dos Santos and Ms. Sueli A. Neves for valuable technical assistance. CAPES and FAPESP process n. 99/10643-7 supported this research. O Comité de Ética da investigação aprovou o projecto (processo: CONEP n. 25000.074430 / 2001-88).

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