Clotianidina de sementes-tratamento não tem detectáveis impacto negativo em colónias de abelhas e seus patógenos

Estudo

Em 2013, um total de 16 campos (8.9 ± 5.4 ha; média ± s.d.) no sul da Suécia, destina-se para a primavera-semeado sementes de colza (Brassica napus L.) foram pareados de acordo com a proximidade geográfica (mas separadas por >4 km) e do uso da terra (Fig. 1, ver acima). A paisagem circundante foi inspeccionada para detectar a ausência de culturas em flor. No entanto, em 2013, dois campos permaneceram no estudo, embora outro campo de colza estivesse presente nas proximidades, de modo a manter o maior número possível de pares de explorações 34. Em cada par de explorações, foi atribuído aleatoriamente um campo para ser semeado com sementes de colza tratadas com clotianidina, enquanto o outro campo foi semeado com sementes não tratadas com clotianidina (tratado: 8; Controlo: 8). As mesmas explorações emparelhadas foram utilizadas em 2014, mas com os tratamentos invertidos, ou seja, locais com campos tratados em 2013 tiveram campos de controle em 2014 e vice-versa (tratados: 6; controle: 4). Devido à rotação de culturas, diferentes campos dentro de cada fazenda foram usados em 2013 e 2014 (Fig. 1, ver acima). Para criar Fig. 1, baixamos um mapa da Base de dados World Borders (downloadable here: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

a informação sobre as variáveis da paisagem circundante para as diferentes explorações agrícolas em 2014 é apresentada na tabela suplementar 7. Em 2014, metade dos Campos focais tinham colza semeada na primavera (1-13 ha) num raio de 2 km. As sementes tratadas com clotianidina para os campos focais foram revestidas com Elado, uma mistura de duas substâncias activas registada: clotianidina (400 g l−1) e β-ciflutrina (+80 g l−1), escolhidas para este estudo porque foi o tratamento insecticida predominante na colza na Suécia e noutras partes da Europa63. A clotianidina é absorvida pela planta e sistemicamente distribuída a todas as suas partes para protecção contra insects64. a β-ciflutrina não é considerada sistémica e não foram detectados resíduos em amostras colhidas neste estudo 34. Tanto as sementes tratadas com clotianidina como as sementes de controlo foram revestidas com o fungicida tirame em 2013.

Os agricultores participantes foram instruídos a não utilizar outros neonicotinoides nos campos durante o estudo, apesar de outros inseticida pulverizações foliares; principalmente Conduto (pimetrozina), Avaunt/Steward (indoxacarb) e Mavrik (tau-fluvalinato; também usado como varroacide em apicultura) foram utilizados para o controle de pragas (Complementar Tabela 8). No entanto, Biscaya, nome comercial para uma formulação pulverizadora contendo o tiaclopride neonicotinóide, foi aplicado a um campo de controle em 2013, seguido por um spray Mavrik 1 semana depois, e para um campo tratado em 2014, em ambas as ocasiões em 0,3 l ha−1. O tiaclopride tem uma toxicidade aguda consideravelmente mais baixa para as abelhas do que a clotianidin65 e só foram detetadas pequenas quantidades de tiaclopride nas amostras de pólen, néctar e abelhas em 2013 e nenhuma em 2014. While Rundlöf et al.34 não observou qualquer alteração nos resultados quando os campos em que a Biscaia foi aplicada foram excluídos das análises, detectámos algumas alterações qualitativas (quadro suplementar 9). Estas alterações podem dever-se aos mais elevados resíduos de tiaclopride detectados em 2014, mas também podem não se relacionar com a Biscaia, mas sim com a diferença entre a Biscaia/Mavrik e as combinações alternativas de insecticida pulverização used34 ou ser devidas a uma menor potência estatística.

colónias de Abelhas

cento e dezesseis colónias de abelhas foram preparadas no final de Maio de 2013, por um profissional registrado no único full-size colmeias Langstroth, contendo dois pentes, principalmente com selada ninhada (abelhas), dois favos de mel (abelhas), uma vazia pente, cinco favos com cera fundação, abelhas abalado com dois pentes e um 1 ano de idade (84 experimental colónias) ou 2 anos (12 experimentais colônias, acrescido de 20 de reserva colônias) a rainha do conhecido descida para produzir relativamente pequeno, de tamanho igual (3418 ± 123 abelhas adultas; média ± s.e.m.; N = 96 colônias) colônias com muito espaço para o crescimento que poderia se tornar forte o suficiente para sobreviver ao inverno que se aproxima, mas não superar o seu espaço durante o verão. Seis colónias experimentais foram colocadas ao longo da borda do campo em cada um dos 16 campos de colza (96 colónias no total) entre 14 e 28 de junho de 2013, no início da floração da colza (Figo suplementar. 1). A linhagem e a idade das rainhas foram combinadas entre pares de quintas, mas as colónias foram distribuídas aleatoriamente. As colónias foram mantidas num campo de colza de Inverno de 60 ha, gerido organicamente, em plena floração, antes de serem colocadas nos 16 campos experimentais (Figo suplementar. 1) para garantir o crescimento pré-experimento de colônias foi baseado, tanto quanto possível, em foraging sem pesticidas.

quando a floração da colza no campo experimental tinha cessado, as colónias foram transferidas entre 2 e 31 de julho (Figo suplementar. 1) a um apiário comum para o inverno. Em 10 de agosto, as colónias receberam um tratamento de vapor de ácido fórmico contra os ácidos Varroa, consistindo em 20 ml de ácido fórmico a 60% embebido numa esponja doméstica plana colocada sob a cobertura interna em cima dos quadros. As colónias foram alimentadas com um total de 20 kg de açúcar por Colónia sob a forma de uma solução de sacarose de 55-60% v/v, fornecida numa caixa de alimentação em três ocasiões durante Agosto–Setembro de 2013. Em 4 de dezembro, foi efectuado um tratamento adicional da Varroa luminosa através da aspersão de 30 ml de ácido oxálico a 2,6% em 60% de sacarose entre os quadros, directamente para o aglomerado de abelhas. Na primavera de 2014, as colónias foram transferidas para um campo de colza gerido organicamente antes de serem colocadas nos 10 campos de colza semeada na primavera (Figo suplementar. 1). Colônias foram consideradas para inclusão na parte de 2014 do estudo se eles tinham uma rainha de postura de ovos de 2 anos em abril de 2014 (excluindo colônias que morreram, re-quedou ou teve rainhas de 3 anos de idade em abril de 2014) e não tinha swarmed até o início de junho de 2014. Estas restrições, para além do requisito de que as colónias seriam expostas/não expostas à clotianidina durante os dois anos da experiência, significaram que, em 2014, apenas quatro colónias poderiam ser atribuídas a cada campo. Colônias colocadas por campos tratados em 2013 foram novamente colocadas por campos tratados em 2014, de modo a avaliar os efeitos cumulativos da exposição à clotianidina multi-ano, mas foram de outra forma re-randomizados antes da colocação para minimizar vieses não intencionais. Mesmo assim, duas colónias de controlo a partir de 2013 tiveram de ser colocadas por um campo tratado com clotianidina em 2014, devido à insuficiente qualificação das Colónias expostas para os seis campos tratados com clotianidina. Colônias suficientes estavam disponíveis para os quatro campos de controle. A força das colônias foi igualada como descrito para 2013, mas apenas dentro de cada grupo de tratamento. As colônias foram reduzidas e equalizadas uma segunda vez (8 de junho de 2014), depois que algumas delas cresceram muito e tentaram enxamgar (Fig suplementar. 1). Cada Colónia reduzida incluía 1 favos completos de mel (com abelhas), 3 favos com descendência principalmente selada (com abelhas) e a rainha original a partir de 2013 e 6 favos com base de cera. As colônias foram transferidas para os campos de colza de primavera entre 16 e 25 de junho de 2014 e trazidas de volta para o local comum de inverno entre 14 e 22 de julho de 2014 (Figo suplementar. 1).Foram analisados em cada local resíduos de clotianidina

análises de resíduos

para confirmar a exposição à clotianidina, 24 abelhas adultas por campo capturadas à entrada da colmeia, pellets de pólen colhidos de 5 abelhas forrageiras nos campos de colza e néctar retirados dos estômagos de 5 abelhas produtoras de néctar nos campos de colza. O pólen (>25 ml) foi colhido utilizando armadilhas de pólen, que foram instaladas durante um dia em três colónias por local e analisadas para determinar a origem das espécies vegetais. As amostras foram manuseadas e analisadas como em Rundlöf et al.34 e recolhidos durante as avaliações da floração máxima em ambos os anos (Fig. complementar. 1), com as concentrações de clotianidina e outros quatro neonicotinoides usados na Suécia (Complementar Tabela 2) quantificados utilizando cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e pólen identificados para canola tipo usando microscopia de luz e um pólen biblioteca de referência (ver Quadro Suplementar 2 para os limites de detecção e quantificação). Para mais análises da variação da exposição neonicotinóide de abelhas em diferentes locais, recolhemos 12 abelhas por local a partir da entrada da colmeia. Esta amostragem foi realizada em três locais tratados com clotianidina em 2013. O néctar foi extraído do estômago de mel das abelhas coletadas. As concentrações de clotianidina foram posteriormente quantificadas, tanto no néctar como no tecido das abelhas, para cada abelha. Os métodos suplementares fornecem mais pormenores sobre o tratamento da amostra para diferentes matrizes, o método CL-MS/MS e os controlos de qualidade.

Colony development, re-queening and honey production

Honeybee colony development was assessed by the same trained observer and one assistant. A presença de uma rainha poedeira foi estabelecida, bem como a presença de células da Rainha. Se um evento de re-rainha foi acompanhado por uma grande perda de abelhas adultas, ele foi considerado como tendo crescido. Se não foi observada qualquer perda de abelhas adultas, considerou-se que a colónia voltou a fazer filas através da supersedura. A produção e o desenvolvimento de mel de Colónia foram determinados pesando as colónias e avaliando a resistência das Colónias utilizando o método de Liebefeld 66, como o número total de abelhas adultas e a área da ninhada coberta em todos os quadros. O número de abelhas adultas foi estimado contando abelhas em ambos os lados dos 10 quadros. O número de células de ninhada (quantidade de ninhada) foi determinado multiplicando a proporção de cobertura de ninhada fechada por 2700, que é o número de células de um dos lados dos quadros utilizados. As colónias foram pesadas durante as avaliações Pré-Exposição e pós-exposição (utilizando uma escala bench Mettler Toledo capaz de pesar até 32 kg com uma precisão de 1 g), para estimar a produção de mel. Quadros completos de mel foram substituídos por quadros vazios durante o florescimento da colza, para permitir que a colônia cresça e reduza o enxame. Pesaram-se tanto os quadros completos como os vazios, para inclusão no cálculo da produção de mel. Durante a avaliação pós-exposição, foram removidos o maior número possível de armações de mel (no máximo 10% da área coberta de ninhada coberta) para simular a colheita de mel dos apicultores. As avaliações de pré-exposição foram realizadas no campo de colza de Inverno semeada organicamente em 6-17 de junho de 2013 e 9-11 de junho de 2014 ,e as avaliações de pós-exposição no apiário comum de inverno em 29 de julho a 9 de agosto de 2013 e 28-31 de julho de 2014 (Figo suplementar. 1). Além disso, em abril de 2014, foi realizada uma avaliação da resistência das colónias de primavera, estimando o número total de abelhas adultas e o número de crias Cobertas (figos suplementares. 1). O avaliador da colônia e assistentes foram cegados durante a coleta de dados no que diz respeito ao regime de tratamento dos Campos.

a colheita e o processamento de amostras de agentes patogénicos e parasitas

amostras de cerca de 100 abelhas adultas foram colhidas em cada Colónia durante as avaliações pré e pós – exposição nos campos de colza experimentais tratados com clotianidina e de controlo em 2013 e 2014 (Figo suplementar. 1). As abelhas foram retiradas do pente exterior de cada Colónia e consistiram, portanto, numa mistura de abelhas domésticas e de abelhas forrageiras 67. Todas as amostras de abelhas foram armazenadas a -20 °C até que o trabalho de laboratório foi realizado. O V. as taxas de infestação por destruidores para cada colônia foram determinadas lavando as amostras de abelhas adultas com água de sabão para desalojar e contar as mites68. Os abdomes de 60 abelhas adultas por Colónia (para análises individuais de colónias) ou por apiário (para as análises agrupadas de colónias em 2013, 10 abelhas por Colónia) foram removidos e colocados num saco de polietileno com uma malha interna (BioReba). Os abdomes foram triturados no saco utilizando uma pá e 30 ml de água sem nuclease (Milli-Q) (0, 5 ml por abelha) foram misturados cuidadosamente com a amostra para criar uma suspensão homogénea. Várias alíquotas de 1 ml desta suspensão foram removidas e congeladas imediatamente a -80 °C para extracção de ADN e ARN e como material de referência futuro.

parasitas, agentes patogénicos, micróbios simbióticos e genes imunitários

as amostras de abelhas colhidas foram avaliadas relativamente a uma variedade de parasitas e micróbios patogénicos e não patogénicos, a fim de estudar a colocação de impacto das Colónias nos campos tratados com clotianidina na sua prevalência e abundância. Os organismos incluíram o omnipresente ectoparasite Varroa destructor, 13 vírus: paralisia aguda de abelhas vírus (ABPV), pulgão letal paralisia vírus (ALPV), Grande Rio Sioux vírus (BSRV), rainha negra célula de vírus (BQCV), crônica abelha paralisia vírus (CBPV), vírus deformado da asa-tipo A (DWV-A), vírus deformado da asa tipo-B (DWV-B), vírus Israelense de paralisia aguda (IAPV), Caxemira abelha vírus (KBV), Lago Sinai estirpe do vírus 1 (LSV-1) e tensão 2 (LSV-2), Sacbrood vírus (SBV), lento abelha paralisia vírus (SBPV); duas abelhas microsporidian intestino parasitas (Nosema apis e Nosema ceranae) e dois simbiose com bactérias intestinais (Gammaproteobacterium: Gilliamella apicola e Betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). Para 2013 amostras foi também analisado no apiário nível, os níveis de mRNA de oito abelhas genes (Amil/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1A, Comedor-como, NimC2, PGRP-S2 e SPH51) cuja expressão anteriormente tinha sido ligadas aos pesticidas, patógenos e/ou parasita exposure19,44 (social) imunidade em honeybees45.

a extracção de ácido nucleico

o ADN foi extraído dos homogeneizados das abelhas utilizando o Protocolo para a extracção de ADN dos esporos69 Nosema, que é suficientemente robusto para também extrair ADN de bactérias e outros microrganismos. Centrifugou-se um total de 500 µl de homogeneizado primário de abelha durante 5 minutos num microfuge a 13 000 rpm. O sedimento foi repetidamente descongelado com nitrogênio líquido e moído com um micropestle estéril de Teflon até pulverizado. O sedimento pulverizado foi ressuspendido em 400 µl de tecido vegetal Qiagen tampão de lise DNeasy AP1 contendo 4 µl RNAse−A (10 mg ml-1) e incubado e agitado durante 10 minutos a 65 oC, após o que 130 µl de tampão de neutralização P3 (3,0 M de acetato de potássio pH 5.5) foi adicionado, seguido por 5 minutos de incubação no gelo e Centrifugação por 5 minutos a 14.000 rpm para remover os detritos de lise. O ADN foi purificado a partir de 500 µl do sobrenadante pelo robô de extracção automatizado Qiagen do Qiacubo, seguindo o protocolo de Pneasy da planta e eluindo o ADN em 100 µl de água sem nucleases. O RNA foi extraído pelo robô Qiacube diretamente a partir de 100 µl de homogeneizado primário de abelha usando o protocolo RNeasy da planta Qiagen (incluindo o Qia-shredder para homogeneização adicional 70) e o RNA foi eluído em 50 µl de água sem nucleases. O número aproximado de ácido nucleico concentração foi determinada por NanoDrop, após o que as amostras foram diluídas com nuclease de água livre para um uniforme de 10 ng µl−1 (DNA e LSV-1(RNA) ou de 20 ng µl−1 (para todas as outras amostras de RNA) e armazenado a -80 °C.

RT-de acordo com pcr e de acordo com pcr

A diversos microrganismos e de acolhimento de mRNA metas foram detectados e quantificados por Uma Etapa de transcrição reversa-quantitativa de PCR (RT-de acordo com pcr) para patógenos com um genoma de RNA e o sistema imunitário e a referência interna do mRNA do gene destinos ou por PCR quantitativo (de acordo com pcr) para os organismos com um DNA do genoma. Os pormenores dos ensaios são apresentados no quadro 10, no quadro 11 e no quadro 12. O primário reverso para Amel / LRR foi ligeiramente re-desenhado a partir de Di Prisco et al.19 porque a complementaridade extremamente elevada entre os primers dianteiros originais e inversos resultou em altos níveis de artefatos PCR dominando o sinal quantitativo. As reacções foram conduzidas em duplicado, em 20 µl (ADN) ou 10 µl (ARN) volumes de reacção contendo 2 µl (ADN) ou 1,5 µl (ARN) modelo, 0,4 µM (ADN) ou 0.2 µM (RNA) de iniciador dianteiro e reverso e quer a Bio-Rad mistura de qPCR Verde Eva (ADN) ou a Bio-Rad mistura ITAQ RT-qPCR de uma etapa com a química de detecção verde SYBR (RNA). As reacções foram incubadas em placas qPCR ópticas de 96 alvéolos no termociclo de ligação Bio-Rad CFX connect, utilizando os seguintes perfis cíclicos de amplificação: 10 minutos a 50 ° C para síntese complementar de ADN (cDNA) (apenas RT-qPCR): 5 minutos a 95 ° C (para inactivar a transcriptase reversa e activar a polimerase Taq), seguidos de 40 ciclos de 10 s a 95 °C para a desnaturação e de 30 s a 58 °C para o recozimento, extensão e recolha de dados de iniciação. Para os ensaios de ADN, foram utilizados os seguintes perfis do ciclo de amplificação: 2 minutos a 98 °C para a desnaturação inicial, seguidos de 40 ciclos de 5 s a 98 °C para a desnaturação e 10 s a 60 °C para o recozimento, extensão e recolha de dados de iniciação. Os ciclos de amplificação foram seguidos por uma análise da curva de fusão para determinar a especificidade da amplificação através da leitura da fluorescência a incrementos de 0,5 °C de 65 °C a 95 °C. Os controlos de ensaio incluídos em cada placa de reacção foram positivos e negativos (não-template). Para cada tipo de ensaio (quadro suplementar 10, Quadro suplementar 11 e quadro suplementar 12), foi preparada uma curva de calibração através de uma série de diluição de 10 vezes com um controlo positivo da concentração conhecida que abrange 6 ordens de grandeza, para a conversão quantitativa de dados, estabelecendo o perfil da curva de fusão de referência do amplicão e estimando as estatísticas de desempenho da reacção.As curvas de fusão das reacções individuais foram avaliadas visualmente a fim de separar as amplificações não específicas, que diferem nos perfis de temperatura de fusão dos verdadeiros amplicons cDNA/ADN-alvo. As amplificações não específicas foram eliminadas do conjunto de dados. Todos os ensaios foram executados em duplicado, com o valor médio destes dois duplicados utilizados em outros cálculos. Ambos os duplicados tiveram de produzir um valor quantitativo positivo e passar a análise da curva de fusão para os dados a incluir no conjunto de dados. Os dados brutos de RT-qPCR de todas as amplificações confirmadas foram subsequentemente convertidos para números de cópias estimados de cada ARN-alvo, utilizando a curva de calibração correspondente para o ensaio. Estes dados foram multiplicados pelos vários factores de diluição ao longo do procedimento para calcular as cópias estimadas de cada objectivo por bee69. Uma vez que o ARN é facilmente degradado, existe o risco de que as diferenças entre amostras individuais na qualidade do ARN (ou seja, degradação) possam afectar os resultados 70. Para corrigir esta situação, foram efectuados testes de RT-qPCR para o ARNm de um gene de referência interno comum de abelhas (RP49) em todas as amostras. Os dados para os objetivos de RNA de interesse foram então normalizados para o valor médio para o mRNA RP49, corrigindo assim os dados para diferenças específicas da amostra na qualidade de RNA em relação ao desempenho RT-qPCR 70.

análises estatísticas

as proporções de pólen colhido de abelhas originadas de plantas do tipo colza foram comparadas entre tratamentos (tratamento de sementes de clotianidina/não tratados) utilizando um modelo linear generalizado assumindo a distribuição binominal e corrigindo a sobredosagem. As concentrações de clotianidina no néctar e pólen colhidos pelas abelhas e no tecido das abelhas foram comparadas entre tratamentos utilizando testes de Wilcoxon–Mann–Whitney. Para comparar as concentrações de clotianidina no tecido da abelha e néctar em abelhas individuais entre os campos, utilizámos análises da variância (ANOVA), com a identidade do campo como preditor. Além disso, as concentrações de clotianidina nos tecidos e no estômago de néctar de abelhas individuais estiveram relacionadas utilizando uma regressão linear múltipla com a identidade do campo e a concentração de clotianidina no néctar como variáveis explicativas e a concentração de clotianidina no tecido de abelhas como variável de resposta.

o estudo seguiu, em geral, um desenho antes do impacto após o controlo (BACI), com uma estrutura de campo emparelhada, repetida durante dois anos consecutivos a nível das colónias para dados sobre o desenvolvimento das Colónias, bem como a prevalência e abundância de parasitas, agentes patogénicos e bactérias intestinais. Os anos de 2013 e 2014 foram analisados em conjunto em um modelo completo, com tratamento de sementes, floração, ano e suas interações como fatores fixos. O efeito do tratamento com clotianidina foi avaliado pela interacção entre o florescimento e o tratamento de sementes, uma vez que este termo reflecte a diferença entre os tratamentos em relação ao(s) Flor (s) de colza. Se os três maneira de interação (bloom × tratamento de sementes × ano) foi significativa (por exemplo, se a variável respondeu de forma diferente para a clotianidina tratamento de um ano para o outro), o conjunto de dados foi dividido por ano e o ano foi colocada como um fator fixo. Além disso, o conjunto de dados foi analisado para apenas 1 ano se os dados consistissem numa amostra de dimensão ≤10 num ano, tanto para a prevalência do microbiota como para a abundância (quadro suplementar 1). As colónias que enxamearam (8 nos campos de controlo e 10 nos campos tratados com clotianidina em 2013; uma num campo de controlo e duas nos campos tratados com clotianidina em 2014) foram excluídas da análise, uma vez que o enxame tem um grande efeito no desenvolvimento das Colónias. Também está excluída a única colônia que perdeu sua rainha durante o transporte antes da colocação no campo em 2013 (campo tratado). Excluindo as colónias que se enxergaram a partir da análise, alteraram qualitativamente alguns resultados (Ver Tabela complementar 13). As alterações no nível de significância podem ser devidas à redução da potência estatística, ao acaso aleatório ou aos efeitos biológicos.Foram utilizados modelos lineares de efeitos mistos (MML) para testar o efeito do tratamento com clotianidina no desenvolvimento das Colónias, medidos como o número de células de descendência coberta (quantidade de descendência) e o número de abelhas adultas. O tratamento de sementes (clotianidina ou controlo), flor (antes ou depois da floração de colza), ano (2013 ou 2014) e as suas interacções foram factores fixos. A identidade do par da fazenda, a identidade da fazenda e a identidade da colônia foram incluídas como fatores aleatórios. A produção de mel foi comparada entre tratamentos que utilizam uma LMM com a identidade do par e a identidade da exploração como fatores aleatórios. Foram utilizados modelos mistos lineares generalizados (GLMMs) para testar a influência do tratamento com clotianidina no re-re-queamento e mortalidade das Colónias com a identidade da exploração como factor aleatório.

A influência da clotianidina tratamento na primavera colônia de desenvolvimento, medido como o número de abelhas adultas e a quantidade de ninhada, foi testada utilizando-se um LMM e um GLMM, respectivamente, com o tratamento de sementes como fator fixo e fazenda par de identidade e fazenda identidade como fatores aleatórios. Para o número de células nativas Cobertas, usamos uma distribuição de erro binomial negativo e função logarítmica de ligação.

O microbiano e ácaro Varroa dados foram analisados tanto em sua binomial (presença/ausência) e quantitativos (abundância) caracteres, utilizando GLMMs (com binomial erro distribuições e uma função de ligação logit) e LMMs (com erro normal distribuições), respectivamente, com o tratamento de sementes, flor, ano e suas interações como factores constantes. GLMMs on microorganism or Varroa mite prevalence included only colony identity as random factor, as the effective sample size (i.e., the less frequent outcome of the presence / absence data) did not allowed for the inclusion of more random factors. Apenas foram analisados organismos e anos com uma dimensão (efectiva) da amostra >10, tanto para a prevalência como para os dados de abundância. Além disso, as colónias que pelo menos uma vez não apresentaram resultados positivos para um determinado microrganismo foram excluídas da análise da abundância. O patógeno das abelhas e a abundância bacteriana foram logaritmicamente transformados (log10), uma vez que são geralmente distribuídos exponencialmente. As LMMs sobre a abundância do organismo-alvo continham a identidade dos pares de explorações, a identidade da exploração e a identidade das colónias como factores aleatórios. O número de ácaros Varroa por 100 abelhas e o peso das Colónias foram transformados de raiz quadrada para evitar resíduos não normalmente distribuídos. Os intervalos de confiança foram calculados com base na probabilidade do perfil. Para os dados transformados de raiz quadrada, as estimativas foram transformadas de volta para a escala original para ilustrações gráficas.

as transcrições dos genes imunológicos só estavam disponíveis para 2013 e a nível apiário, mas também seguiram o desenho da BACI. LMMs na expressão genética continha tratamento de sementes e bloom como fatores fixos e identidade da fazenda como fatores aleatórios.

foram realizadas análises de dados estatísticos utilizando R, excepto para análises que abordam a verificação da exposição à clotianidina e do uso do solo, para as quais o SAS 9.4 para Windows (SAS Institute Inc.) foi utilizado. LMMs eram adequados usando a função lmer do pacote lme4 e GLMMs eram adequados usando a função glmmTMB do pacote glmtmb em R. P os valores de GLMMs foram calculados por testes de relação de probabilidade. Os valores de P de LMMs foram calculados utilizando a função Anova da embalagem automóvel, em que foram utilizados testes F Tipo III para modelos que contêm interacções e testes F Tipo II para modelos sem interacções (isto é, Avaliação da primavera e produção de mel). Os efeitos dos factores fixos foram estimados utilizando contrastes entre soma e zero em todos os modelos, excepto nos resíduos neonicotinóides. Os contrastes soma-zero permitem a determinação dos principais efeitos / interações (ou seja, estimativa independente de outras variáveis independentes) e mostram os efeitos dos fatores como desvios da grande média (interceptação). Para fatores com dois níveis, a magnitude do desvio de cada nível em relação à média geral é a mesma, mas a direção difere. Nós representamos efeitos de fatores (tratamento de sementes, floração, ano), como o desvio do segundo nível (clotianidina, depois, 2014) da grande média. Este foi também o caso das interacções, de modo que, por exemplo, o tratamento de sementes × interacção com o bloom indica em que medida as colónias expostas à clotianidina diferiram em relação ao florescimento da colza da alteração média de ambos os tratamentos.

Power analysis

we performed power analyses for number of adult bees and the number of capped brood cells and honey production to investigate the effect size we could potentially detected given our design, replication and model choice. A potência foi determinada para uma gama de tamanhos de efeito a um nível de confiança nominal de α = 0,05 por 1000 simulações de Monte Carlo por tamanho de efeito usando a função powerSim do pacote simr. A potência foi calculada para uma gama de tamanhos de efeito, expressa como a alteração do número de abelhas adultas, o número de células de reprodução cobertas ou a produção de mel. Dividindo o tamanho do efeito pelo número médio de abelhas, o número médio de células de ninhada ou a produção de mel de todas as colónias de controlo, obtivemos o tamanho do efeito expresso como a variação percentual dessas matrizes (Figo suplementar. 3). Esta análise de poder tornou possível comparar o nosso tamanho do efeito com o tamanho do efeito apresentado por Rundlöf et al.34. Utilizando o modelo completo, poderíamos detectar um tamanho de efeito para o número de abelhas adultas inferior a 5% com uma potência de 80% em comparação com o tamanho de efeito inferior a 20% apresentado por Rundlöf et al.34. Este valor é ainda inferior aos requisitos de um tamanho de efeito <7% estabelecidos pela EFSA32. Como resultado de uma interacção significativa do tratamento de sementes, bloom e year, O conjunto de dados para o número de células ninhadas Cobertas foi analisado separadamente para cada ano. Portanto, apresentamos aqui a análise de poder para cada ano. O tamanho do efeito em que 80% foi alcançado aumentou de Abaixo de 10% em 2013 para um pouco abaixo de 11% em 2014 (Figo suplementar. 3), provavelmente devido à replicação reduzida em 2014. Também realizamos uma análise de potência da produção de mel (quantidade de mel por colônia em kg) Usando o conjunto de dados de ambos os anos, mostrando que um tamanho de efeito inferior a 20% poderia ser detectado com uma potência de 80% (Figo suplementar. 3).O resumo da investigação sobre a natureza ligado a este artigo contém mais informações sobre a concepção experimental.