Colony PCR
Colony PCR is a convenient high-throughput method for determining the presence or absence of insert DNA in plasmid constructts. Os transformadores individuais podem ser lisados em água com um passo de aquecimento curto ou adicionados diretamente à reação de PCR e lisados durante o passo de aquecimento inicial. Este passo inicial de aquecimento causa a liberação do DNA plasmídeo da célula, para que possa servir como modelo para a reação de amplificação. Os iniciadores projetados para direcionar especificamente o DNA inserido podem ser usados para determinar se a construção contém o fragmento de DNA de interesse. Alternativamente, os iniciadores visando o DNA vetorial flanqueando a inserção pode ser usado para determinar se a inserção é ou não o tamanho molecular correto. Insert specific primers can provide information on both the specificity and size of the insert DNA while the use of vector specific primers allows screening of multiple constructs simultaneously. O PCR de Colônia também pode ser usado para determinar a orientação de inserção. A amplificação PCR do plasmídeo usando um iniciador específico de inserção emparelhado com um iniciador específico de vetor pode ser projetado para produzir um fragmento amplificado de um tamanho específico apenas se a inserção estiver na orientação correta. Em todos os projectos experimentais, a presença ou ausência de um fragmento amplificado de PCR e o tamanho do produto são determinados por electroforese, juntamente com um marcador de tamanho de ADN num gel de agarose.
