Diversidade Clonal de um tumor mieloma: de gerações de células a implicações de tratamento
o conceito de diversidade clonal está se tornando bem aceito como uma marca de câncer. À medida que um tumor cresce e progride, a paisagem genética da população celular pode mudar. Estas mudanças são em grande parte devido a erros aleatórios que ocorrem durante cada divisão celular ou através de eventos mutacionais estimulados por várias exposições. Quando um destes eventos aleatórios ocorre no local certo, ele resultará em uma vantagem de sobrevivência para todos os descendentes subsequentes dessa célula inicial. Compreender os fundamentos da diversidade clonal pode ser uma parte essencial do plano de tratamento para os pacientes, ajudando a orientar a seleção de medicamentos e a determinar a porcentagem de clones que podem ser sensíveis/resistentes a tratamentos específicos. Além disso, muitas das terapias utilizadas no tratamento do mieloma irão provavelmente induzir mutações através dos seus mecanismos de acção ou através de efeitos secundários inesperados. Compreender os efeitos de terapias individuais e combinações específicas sobre as taxas de mutação subjacentes que impulsionam a diversidade de uma população de tumor ajudará a identificar regimes que aumentam a taxa de mutação subjacente e colocar o paciente em um risco aumentado de desenvolver um clone agressivo. Estas mudanças podem ser identificadas pela sequenciação da próxima geração da população de tumor em massa em comparação com clones de células únicas que foram selecionados a partir dessa população. A fim de identificar a diversidade de mutações encontradas em massa tumoral população, propomos que a única célula de clonagem pai população, e, em seguida, o seqüenciamento e a comparação entre vários clones vai lhe dar uma melhor idéia do acaso variedade de mutações presentes em células individuais que se originam do mesmo pai população.
para identificar a diversidade presente numa população aleatória de células mielomas, seleccionámos a linha celular do mieloma humano KMS-18 como um sistema modelo. Separámos células individuais da população-mãe do KMS-18 por FACS com os critérios de selecção baseados unicamente nas células viáveis e únicas. Estas células separadas individualmente expandiram-se ao longo de um período de semanas até a população ser suficientemente grande para ser recolhida para análise (visar aproximadamente 5e6 células). Quatro destes clones de células únicas foram selecionados para análise (SCC_04, SCC_10, SCC_16, SCC_18). Preparamos bibliotecas de genoma inteiras e capturamos uma região de 3,2 Mb usando o Kit de captura de Kinome do Agilent SureSelect. As bibliotecas de captura finais foram sequenciadas na plataforma Illumina MiSeq a uma profundidade média da região alvo de 200X.
os resultados foram filtrados para identificar o número de mutações presentes exclusivamente em um subclone em comparação com outro. Tais eventos ou existiam na única célula original ou ocorreram no início da expansão do clone da única célula. Para limitar a análise a eventos presentes na única célula original ou muito cedo no processo de duplicação, identificamos as variantes que foram encontradas em uma frequência >20%. Muitos desses eventos estavam presentes em vários clones de células únicas que poderiam definir a relação clonal de cada célula original, no entanto, 10% dessas variantes eram únicas para um único subclone. Em média, observaram-se 1, 6 mutações por Mb da região-alvo. Se esta mesma taxa de mutação se mantiver verdadeira em todo o genoma, esperaríamos ver mais de 5000 mutações únicas entre quaisquer duas células aleatórias retiradas de uma amostra de tumor em massa.
estudos estão atualmente em curso para examinar a diversidade clonal entre gerações de subclones. Estudos adicionais também estão em andamento para analisar mudanças na diversidade clonal entre diferentes subtipos do mieloma, com a hipótese de que subtipos mais agressivos como t(4;14) e MAF podem levar a uma população clonal mais diversificada. Se uma população clonal mais diversificada se correlacionar com o subtipo tumoral mais agressivo, então isso retorna o círculo completo à questão das terapias apropriadas, e se certas terapias podem realmente aumentar a diversidade na população tumoral e resultar em uma recaída mais agressiva da doença.
não há conflitos de interesses relevantes a declarar.
