Dois Chloroflexi classes de forma independente evoluiu a capacidade de persistir em atmosférica de hidrogênio e de monóxido de carbono | A ISME Journal

Thermomicrobium roseum upregulates hidrogenase e monóxido de carbono desidrogenase de expressão durante uma resposta coordenada a fome de nutrientes
T. roseum aerobicamente oxida H2 e CO em uma ampla faixa de concentrações, incluindo os sub-níveis atmosféricos, durante a persistência
a remoção de gases atmosféricos é potencialmente uma estratégia comum de persistência dentro do Cloroflexo heterotrófico aeróbico
Ecológicos e biogeoquímicos importância da flexibilidade metabólica e gases traços de oxidação em Chloroflexi

Thermomicrobium roseum upregulates hidrogenase e monóxido de carbono desidrogenase de expressão durante uma resposta coordenada a fome de nutrientes

comparamos as transcriptomes de triplicado T. roseum culturas sob rico em nutrientes (crescimento exponencial) e nutrientes limitados (fase estacionária) condições. Um total de 401 genes foi significativamente aumentado e 539 genes foram significativamente reduzidos em pelo menos duas vezes (p < 10-6) em resposta à limitação de nutrientes (Fig. 1a; quadro S1). Foram observadas três tendências principais no que respeita à aquisição e utilização de energia. Em primeiro lugar, os genes associados a processos energeticamente caros foram reduzidos, incluindo os que codificam proteínas ribossómicas, enzimas de biossíntese citocromo c e menaquinona, e o aparelho quimiotático e flagelar codificado megaplasmídeo (tabela S1). Em segundo lugar, houve evidência de mobilização de reservas internas de carbono, incluindo um complexo de acetoin desidrogenase e um complexo de flavoproteína de transferência electrónica (ETF). Em terceiro lugar, os perfis de expressão indicam que há uma remodelação extensa da cadeia respiratória. Dois respiratório primário dehydrogenases envolvidos na heterotróficos crescimento (tipo I e II NADH dehydrogenases) foram desativado, enquanto que os complexos envolvidos na lithotrophic de geração de energia e a succinato desidrogenase foram upregulated (Fig. 1a; quadro S1). Em ambas as condições, as oxidases terminais que mediam a respiração aeróbica foram altamente expressas e não houve evidência do uso de outros aceitadores de elétrons; a citocromo aa3 oxidase foi expressa em ambas as fases e a citocromo bo3 oxidase alternativa foi aumentada durante a fase estacionária. Em contraste, a F1Fo-ATPase (ATP sintase) foi subestimada, um achado consistente com uma diminuição esperada na disponibilidade de doadores de elétrons respiratórios durante a limitação de nutrientes (tabela S1).

o Roseum Termomicrobium eleva os genes associados ao metabolismo do H2 e do CO em condições limitadoras dos nutrientes. Os genes que codificam as subunidades estruturais de um grupo de 1h -hidrogenase (hhyLS; trd_1878–1877) , que são uma classe de oxigênio tolerante enzimas conhecidas para mediar atmosférica H2 oxidação , foram como potenciadas por uma média de 12,6 vezes (Fig. 1b). As proteínas hipotéticas conservadas hhaABC (trd_1876-1874; 5.5 vezes), codificado no mesmo operon putativo que as subunidades estruturais, bem como um operon putativo separado de fatores de maturação (trd_1873–1863; 3,1 vezes) (figura S2; tabela S1). As subunidades estruturais (trd_1206–1208) e de maturação (trd_1209–1215) que codificam uma desidrogenase de monóxido de carbono do tipo I foram regularizadas em média duas vezes (Fig. 1c & S2) em resposta à limitação de nutrientes. De acordo com relatórios anteriores de utilização de CO durante o crescimento deste organismo , os genes de monóxido de carbono desidrogenase foram altamente expressos tanto em culturas exponenciais como em culturas em fase estacionária. (Figo. 1C; quadro S1). Isto sugere que T. roseum usa CO para complementar o carbono orgânico disponível durante o crescimento (mixotrofia) e persistência. Estes achados são amplamente semelhantes às observações feitas em outros filos, notavelmente Actinobactérias e proteobactérias, que a expressão hidrogenase e monóxido de carbono desidrogenase são induzidas pela limitação Orgânica do carbono .

no geral, o maior diferencial na expressão genética envolveu um cluster de 19 genes (trd_0160-0142) putativamente envolvido com a oxidação de compostos de enxofre. O cluster contém o gene que codifica a um suposto solúvel heterodisulfide redutase (hdrABC), uma transferência de electrões flavoprotein complexo (etfAB), três de enxofre-portador de proteínas (tusA, dsrE1, dsrE2), três lipoate de proteínas de ligação (lbpA), e vários hipotético proteínas, que são como potenciadas por uma média de 45 vezes durante a persistência. A maioria destes componentes tem homólogos em um sistema recentemente mostrado para mediar a oxidação de diversos compostos orgânicos e inorgânicos de enxofre em hifomicrobium denitrificans . Um papel deste aglomerado pode ser mediar a ativação e oxidação de compostos endógenos ou exógenos contendo tiol. Para alcançar isso, nós prevemos que o complexo Hdr catalisa a formação de ligação dissulfeto entre o composto tiol e uma proteína portadora de enxofre (por exemplo, TusA); o complexo Hdr então transfere os elétrons liberados para a cadeia respiratória, possivelmente através do complexo ETF. Apoiando esta noção, a oxidação tiol a dissulfeto é exergônica com oxigênio como o aceitador terminal de elétrons. Embora os complexos Hdr sejam mais caracterizados por seus papéis na redução de heterodissulfeto na archaea metanogênica , eles também foram estudados em bactérias oxidantes e redutoras de sulfatos, onde eles foram preditos para serem fisiologicamente reversíveis . Consistentemente, o complexo Hdr de T. roseum está mais estreitamente relacionado com as estirpes de Sulfobacillus oxidante, Hifomicrobium e Aciditiobacillus . Parece plausível que T. roseum se beneficiaria de uma vantagem de sobrevivência se pudesse aproveitar compostos de enxofre reduzidos disponíveis em fontes geotérmicas. No entanto, é necessário mais trabalho para verificar a atividade, substratos e papel fisiológico deste sistema.Colectivamente, estes achados mostram que T. roseum é mais flexível metabolicamente do que se pensava anteriormente. Figo. 1d ilustra a remodelação prevista da cadeia respiratória que ocorre durante a transição de condições ricas em nutrientes para condições limitadas em nutrientes. A elevação da regulação das enzimas envolvidas no aproveitamento de compostos inorgânicos, em conjunto com a diminuição da regulação dos grupos genéticos envolvidos na oxidação de NADH, sugere que T. roseum tem desenvolvido mecanismos para manter a respiração aeróbica, apesar das flutuações de nutrientes e privação dentro de seu ambiente.

T. roseum aerobicamente oxida H2 e CO em uma ampla faixa de concentrações, incluindo os sub-níveis atmosféricos, durante a persistência

Os altos níveis de expressão de genes que codificam o grupo de 1h -hidrogenase e tipo eu monóxido de carbono desidrogenase sugeriu que T. roseum pode suportar persistência através da oxidação atmosférica H2 e CO. Para testar isso, incubamos culturas de nutrientes limitadas de T. roseum em espaço livre no ar ambiente, completado com ~14 ppmv de H2 ou CO e monitorizado o seu consumo por cromatografia em fase gasosa. De acordo com nossa hipótese, culturas aerobicamente oxidadas ambos os gases em um processo cinético de primeira ordem; dentro de 71 h, as razões de mistura destes gases (103 ppbv H2, 22 ppbv CO) estavam cinco vezes abaixo dos níveis atmosféricos (Fig. 2a, b). Isto constitui a primeira observação da respiração aeróbica H2 e oxidação atmosférica H2 dentro do filo Cloroflexi.

medições cinéticas de células inteiras revelaram que T. o roseum oxida eficientemente o H2 e o CO numa vasta gama de concentrações através da actividade da hidrogenase e do monóxido de carbono desidrogenase. Nas culturas, as enzimas apresentam uma velocidade aparente moderada (aplicação Vmax de 376 nmol H2 e 149 nmol CO G−1 da proteína min-1) e uma afinidade aparente moderada (aplicação Km de 569 nM H2 e 285 nM CO) para estes substratos (Fig. 2C, d; quadro S2). No que diz respeito ao monóxido de carbono desidrogenase, estas observações são consistentes com o organismo ser capaz de utilizar CO em concentrações elevadas para o crescimento e concentrações atmosféricas para a persistência. Os parâmetros cinéticos aparentes do grupo 1h-hidrogenase são mais semelhantes aos recentemente descritos para o metanotroph Metilacidifilum fumariolicum verrucomicrobial (Km = 600 nM) do que para as hidrogenases de alta afinidade e baixa atividade de H2 previamente descritos (Km < 50 nM) . Ao todo, estes achados sugerem que T. roseum pode tirar proveito das concentrações elevadas de H2 e CO quando disponível através da atividade geotérmica e subsista sobre as concentrações atmosféricas destes gases de outra forma.

consistente com as actividades das células inteiras observadas, os lisados das células funcionam com géis de poliacrilamida nativos fortemente manchados para a actividade da hidrogenase e do monóxido de carbono desidrogenase (Fig. 2e). A massa molecular das principais bandas foi, respectivamente, à massa molecular esperada para um dímero de monóxido de carbono desidrogenase e ligeiramente abaixo da massa molecular esperada de um dímero de hidrogenase . Isto é compatível com estudos bioquímicos em outros organismos que mostraram desidrogenases de monóxido de carbono Tipo I e o grupo 1h-hidrogenases formam homodímeros . Em seguida, verificamos que a hidrogenase foi acoplada à cadeia respiratória medindo a oxidação H2 usando um eletrodo H2 em condições aeróbicas. Células não tratadas oxidaram o H2 a uma velocidade rápida. Esta actividade diminuiu 2, 5 vezes após a adição do CCCP não descolador respiratório e cessou após a adição da valinomicina ionóforo, enquanto que nenhuma alteração significativa na taxa de oxidação H2 foi observável com a nigericina protonóforo (Fig. 2f). A combinação destes resultados sugere que a oxidação do hidrogênio é fortemente acoplados à cadeia respiratória e esta interação pode ser vinculada ao gradiente elétrico (Δψ), mas não o gradiente de pH (ΔpH), da membrana.

os resultados da análise transcriptoma e dos estudos de actividade sugerem, portanto, que T. roseum persiste através da oxidação de H2 e CO atmosféricos. Propomos que o grupo 1h-hidrogenase e o tipo I de monóxido de carbono desidrogenase usem diretamente elétrons derivados da atmosfera H2 e CO para suportar a respiração aeróbica(Fig. 1d). É provável que estes elétrons sejam retransmitidos através de portadores de elétrons para o pool de menaquinona e são posteriormente transferidos para as oxidases terminais. No entanto, são necessários mais estudos para confirmar a forma como estas proteínas interagem funcional e fisicamente com a cadeia respiratória, incluindo a sua localização e com que Portadores de electrões interagem. Devido à intratabilidade genética do Cloroflexi e à falta de hidrogenase específica ou inibidores de monóxido de carbono desidrogenase, também fomos incapazes de determinar a necessidade de H2 ou oxidação de CO para sobrevivência prolongada para este organismo. No entanto, estudos anteriores demonstraram que a eliminação genética do grupo 1h-hidrogenase reduz a longevidade das células M. smegmatis e Streptomyces avermitilis exospores .

a remoção de gases atmosféricos é potencialmente uma estratégia comum de persistência dentro do Cloroflexo heterotrófico aeróbico

tendo demonstrado que T. roseum oxida gases residuais atmosféricos durante a persistência, investigamos posteriormente se esta é uma estratégia comum empregada pelo Cloroflexi. Analisámos primeiro as capacidades respiratórias da Thermogematispora sp. T81, um termófilo heterotrófico celulolítico e esporulador, que anteriormente isolávamos de solos geotérmicos de Tikitere, Nova Zelândia . A análise do genoma do organismo (Assembly ID: GCA_003268475.1) indicou que codifica Componentes da cadeia respiratória do núcleo semelhantes a T. roseum, including primary desidrogenases (nuo, ndh, sdh), terminal oxidases (cox, cyo), and ATP synthase (atp). O genoma também codifica operões putativos para as subunidades estruturais de um grupo 1h-hidrogenase, os fatores de maturação desta hidrogenase, e subunidades estruturais de um tipo I de monóxido de carbono desidrogenase (figura S3). However, homologues of the putative heterodisulfide reductase and ETF complexes encoded by T. roseum are absent from the Thermogematispora sp. Genoma T81.

verificámos que as culturas esporuladoras de Termogematispora sp. T81 consume ativamente H2 e CO. O organismo lentamente oxidado disponível H2 E CO no espaço livre até níveis subatmosféricos (120 ppbv H2, 70 ppbv CO) acima de ~320 h (Fig. 3a, b). Embora esta estirpe tenha sido previamente demonstrada para oxidar o monóxido de carbono , Esta é a primeira observação de que pode fazê-lo para concentrações subatmosféricas e durante a persistência. These results suggest that, despite their distinct evolutionary histories and ecological niches, Thermogematispora sp. T81 e T. roseum desenvolveram estratégias metabólicas semelhantes para sobreviver à limitação de nutrientes.

Análise da distribuição de hydrogenases e monóxido de carbono dehydrogenases dentro publicamente disponível referência do genoma mostrou que a capacidade genética para gás de rastreamento de limpeza é um traço comum entre aeróbico Chloroflexi. Especificamente, o grupo de 1h -hydrogenases e tipo eu monóxido de carbono dehydrogenases foram codificadas em três dos quatro genomas de referência dentro do Thermomicrobiales (classe Chloroflexia) e quatro dos cinco genomas de referência dentro do Ktedonobacteriales (classe Ktedonobacteria) (Fig. 4a, b). Este último inclui os genomas da bactéria heterotrófica do solo Ktedonobacter racemifer e o biorreator oxidante de nitrito Isola Nitrolancea hollandica . Além disso, sete estirpes da ordem fotossintética Cloroflexales codificadas no grupo 1f e/ou no grupo 2a-hidrogenases (figura S4). Estas classes de hidrogenase demonstraram mediar a oxidação aeróbica H2 numa gama de bactérias, incluindo concentrações subatmosféricas em Acidobacterium ailaaui e M. smegmatis, respectivamente . Além disso, um estudo metatranscriptoma revelou que os homólogos do grupo 1f-hidrogenase das espécies Roseiflexus são altamente expressos em tapetes microbianos geotérmicos à noite . Assim, é provável que os traços da respiração aeróbica H2 e possivelmente oxidação atmosférica H2 se estendam às estirpes fotossintéticas deste filo. Uma gama de genomas montados em metagenomas, incluindo da abundante classe candidata Ellin6529, também codificou genes para oxidação aeróbica H2 e CO (figura S4 & s5). Consistente com relatórios anteriores, a Dehaloccoidia codificou o grupo 1a-hidrogenases conhecidas para facilitar a deshalorespiração .

Nossas análises sugerem que a capacidade para atmosférica H2 e CO oxidação pode ter evoluído em duas ou mais ocasiões no Chloroflexi. Árvores filogenéticas mostram que o grupo 1h-hidrogenases de Cloroflexia e Ktedonobacteria são divergentes e caem em dois ramos distintos e robustamente suportados(Fig. 4a). É, portanto, mais provável que a Cloroflexia e a Ktedonobacteria adquiriram independentemente estas enzimas, por exemplo, como resultado de eventos horizontais de transferência de genes de outras Terrabacterias, ao invés de herdá-las verticalmente de um ancestral comum. A análise filogenética também sugere que a desidrogenase de monóxido de carbono Tipo I também pode ter sido adquirida em duas ou três ocasiões neste filo (Fig. 4b). Em linha com a sua provável aquisição independente, os operões putativos que codificam a hidrogenase e monóxido de carbono desidrogenase em T. roseum (figura S2) e Thermogematispora sp. T81 (figura S3) são distintamente organizados. Por exemplo, os fatores estruturais e acessórios do monóxido de carbono desidrogenase são codificados em um único operão putativo em Thermogematispora sp. T81 (coxMSLIG), mas são separados em um operon estrutural (coxGSLM) e operon acessório (incluindo coxG e coxE) em T. roseum. Estes achados concordam com inferências anteriores da disseminação horizontal de genes hhyL e coxL e sugerem que há uma forte pressão seletiva para a aquisição de enzimas metabólicas que suportam a persistência. No entanto, outras explicações para suas observações não podem ser descartadas e análises adicionais são necessárias para desvendar as complexas histórias evolucionárias de hidrogenases e desidrogenases de monóxido de carbono.

Ecológicos e biogeoquímicos importância da flexibilidade metabólica e gases traços de oxidação em Chloroflexi

heterotróficos Aeróbios bactérias do filo Chloroflexi são metabolicamente mais versátil do que se pensava anteriormente. As análises do transcriptoma mostram claramente que T. roseum regula o seu metabolismo em resposta à limitação de nutrientes, permitindo a persistência numa combinação de compostos inorgânicos exógenos e prováveis reservas de carbono endógeno. Em apoio a isso, medições de cromatografia em fase gasosa mostraram que a bactéria oxida eficientemente H2 e CO até concentrações subatmosféricas durante a persistência através de um processo respiratório aeróbico. Fizemos descobertas semelhantes para o isolado ktedonobacterial Thermogematispora sp. T81, suggesting that trace gas scavenging might be a common persistence strategy employed by aerobic Chloroflexi. Análises de filogenia de sequência primária e estrutura de operão indicam que o grupo 1 h-hidrogenases e desidrogenases de monóxido de carbono dentro destes organismos caem em diferentes clados e são relativamente divergentes. Assim, é provável que estes organismos tenham adquirido horizontalmente a capacidade de oxidar o H2 atmosférico e o CO através de eventos separados, embora outras explicações sejam possíveis. A convergência aparente nas estratégias de persistência é notável dadas as distintas histórias evolutivas, morfologias de persistência (isto é, esporulação em T81), e nichos ecológicos dessas bactérias. O generalismo dos recursos é, portanto, provável que seja uma estratégia ecológica comum para a sobrevivência do Cloroflexo em ambientes onde o carbono orgânico e outros nutrientes podem ser periodicamente escassos.

mais genericamente, estes achados fornecem suporte de cultura pura para a hipótese de que o monóxido de carbono atmosférico serve como uma fonte de energia para a persistência . Nossas descobertas sugerem que a expressão e atividade do monóxido de carbono desidrogenase está ligada à persistência, e fornecem evidências de que o CO atmosférico pode servir como um doador de elétrons para a cadeia respiratória aeróbica nesta condição. Com efeito, tal como acontece com o H2 atmosférico, o co atmosférico é provavelmente uma fonte de energia fiável para a sobrevivência microbiana, dada a sua ubiquidade, difusibilidade e densidade de energia. Integrando estes achados com a literatura mais ampla, é provável que a oxidação de CO atmosférico é uma estratégia geral que suporta a sobrevivência a longo prazo de bactérias heterotróficas aeróbicas. Na verdade, várias bactérias heterotróficas foram anteriormente inferidas como capazes de oxidar o CO atmosférico , incluindo proteobactérias , Actinobactérias e uma estirpe de Termogematispora . Além disso, outros conjuntos de dados mostraram que a expressão de monóxido de carbono desidrogenase é ativada durante a limitação de nutrientes em outros organismos aeróbicos . No entanto, em contraste com o H2 atmosférico , continua a ser validado através de estudos genéticos e bioquímicos que a oxidação atmosférica pode aumentar a sobrevivência das bactérias durante a persistência. De acordo com medições anteriores baseadas na atividade , a análise transcriptoma mostra que T. roseum expressa monóxido de carbono desidrogenase em altos níveis durante o crescimento. Ao contrário de carboxidotróficos, como Oligotropha carboxidovorans , T. roseum como carboxydovore não pode crescer chemolithoautotrophically e em vez disso parece usar CO como uma fonte de energia adicional durante o crescimento heterotrófico. A ampla gama cinética da T. roseum monóxido de carbono desidrogenase em células inteiras permite provavelmente que este isolado persista em CO atmosférico ubiquiticamente disponível e cresça mixotropicamente em microambientes onde o CO está disponível em concentrações elevadas (até 6000 ppmv) através da actividade geotérmica .

finalmente, este estudo estabelece o Cloroflexi como o terceiro filo experimentalmente mostrado para dispersar H2 atmosférico, seguindo a Actinobacteria e Acidobacteria . As constatações aqui feitas são semelhantes aos relatados anteriormente para o actinobacterium Mycobacterium smegmatis e acidobacterium Pyrinomonas methylaliphatogenes , os quais também mudança de heterotróficos respiração atmosférica H2 oxidação em resposta à limitação de energia, inclusive por meio de expressar grupo de 1h -hydrogenases. Dado pelo menos quatro outros filos cultivados (Fig. 4a) and two candidate phyla also encode group 1h-hydrogenases, it seems increasingly likely that atmospheric H2 serves as a general energy source for aerobic heterotrophic bacteria. Esta observação também é potencialmente biogeocemicamente significativa, dado que bactérias aeróbias do solo são conhecidas por ser o principal sumidouro no ciclo global de hidrogênio . No entanto, são necessários mais trabalhos para testar se estes princípios se estendem às espécies ainda enigmáticas de Cloroflexos que habitam ambientes de solo mesofílico.

Dois Chloroflexi classes de forma independente evoluiu a capacidade de persistir em atmosférica hidrogênio e monóxido de carbono

Thermomicrobium roseum upregulates hidrogenase e monóxido de carbono desidrogenase de expressão durante uma resposta coordenada a fome de nutrientes

T. roseum aerobicamente oxida H2 e CO em uma ampla faixa de concentrações, incluindo os sub-níveis atmosféricos, durante a persistência

a remoção de gases atmosféricos é potencialmente uma estratégia comum de persistência dentro do Cloroflexo heterotrófico aeróbico

Ecológicos e biogeoquímicos importância da flexibilidade metabólica e gases traços de oxidação em Chloroflexi

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