Estabilização de heterochromatin pelo RELÓGIO promove o rejuvenescimento de células-tronco e regeneração da cartilagem

Anticorpos

Para western blotting: anti-RELÓGIO (#5157, 1:1,000), anti-HP1a (#2616S, 1:1.000) e anti-HP1y (#2619, de 1:3.000 a) da Célula de Tecnologia de Sinalização; anti-KAP1 (Ab22553, 1:2,000), anti-Lamin B1 (Ab16048, 1:1.000) e anti-LBR (Ab32535, 1:1,000) da Abcam; anti-β-actina (sc-69879, 1:3.000 a) da Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) dos sistemas R &D.

Para citometria de fluxo: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) e anti-CD19 (555415, 1:200) de BD Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) e anti-PDPN (17-9381-42, 1:200) de eBioscience (San Diego, CA, EUA); anti-CD29 (303004, 1:200), e anti-CD13 (301705, 1:200), anti-CD166 (343903, 1:200) e anti-CD164 (324805, 1:200) de Biolegend (San Diego, CA, EUA).

cultura celular

CLOCK+/ + hESCs (hESCs, linha H9, Wicell Research Institute) e CLOCK− / − hESCs foram mantidos em camadas alimentadas que consistiam em fibroblastos embrionários do rato inactivados com mitomicina (MEFs) no meio de cultura hESC. O meio de cultura hESC continha DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% de substituição do soro por nocaute (Thermo Fisher Scientific), 0.De 1 mM de aminoácidos não essenciais (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM de GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM de β-mercaptoethanol (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) e 10 ng/mL bFGF (Joint Proteína Central, Incheon, Coreia). Alternativamente, as hESCs foram cultivadas em matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA)-placas revestidas em meio mTeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá).

Ambas as hESC derivada hMSCs e principal hMSCs foram mantidos no MSC meio contendo MEMa (Thermo Fisher Scientific) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (Cat# 10099-141, Lote# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific), e a 1 ng/mL bFGF (Joint Proteína Central, Incheon, Coreia).

edição de genes mediada por CRISPR/Cas9 em hESCs

edição de genes mediada por CRISPR / Cas9 foi realizada através de métodos previamente descritos com algumas modificações.33,34,65 em resumo, um ARN-guia visando exon 5 do CLOCK (CLOCK-gRNA) foi clonado em um vetor de clonagem gRNA (#41824, Addgene) (informações suplementares, tabela S1). Mediante o tratamento com um ROCK inibidor Y-27632 (S1049, Selleck) por 24 h, hESCs (5 × 106) tiverem sido ressuspensas em 100 µL de Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) contendo o plasmídeo coquetel, que consistiu o doador do plasmídeo contendo o homologia braços, RELÓGIO-gRNA e hCas9 (#41815, Addgene), e electroporated em 4D-Nucleofector sistema (Lonza). As células foram então semeadas em células alimentadoras de MEF. O G418 (100 µg/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) foi adicionado para iniciar a selecção positiva 2-4 dias após a electroporação. Após 2 semanas de seleção, clones resistentes ao G418 foram colhidos e transferidos para uma placa de 96 poços para posterior caracterização e expansão. PCR genômico e Western blotting foram usados para a identificação de edição genômica. Adicionalmente, removemos a cassete de resistência à neomicina no CLOCK−/− hESCs por electroporação com o vector pCAG-FLpo-2A-puro. Três dias após a transfecção, foi utilizado 1 µg/mL de puromicina (Thermo Fisher Scientific) para enriquecer as células resistentes à puromicina durante 48 horas. após 8 a 12 dias de selecção, as colónias emergentes foram seleccionadas e expandidas para estudo subsequente.

hmsc generation and characterization

hMSCs were differented from hESCs following a previously published protocol.Em resumo, 25,86,87 hESCs foram dissociados em corpos embrioides (EBs) e tratados com meio de diferenciação (MEMa (Invitrogen) suplementado com 10% FBS (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1mm NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGFß e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) em placas revestidas de Matrigel durante 10 dias até 95% de confluência. Em seguida, as células confluentes do tipo MSC foram digeridas e revestidas com placas revestidas de Matrigel tratadas com meio de cultura MSC contendo Meca (Invitrogen) suplementadas com 10% de FBS, 0,1 mM de NEAAs, 1 ng/mL de bFGF e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco). Depois, as células confluentes do tipo MSC passaram a placas revestidas de gelatina. Os hMSCs foram purificados com diferentes anticorpos correspondentes a marcadores específicos do hMSC (CD73, CD90 e CD105) pelo FACS. O CD73, CD90 e CD105 triplo-células positivas foram mais caracterizados pelo antígeno de superfície marcadores, incluindo positivo marcadores, tais como CD44, CD166, CD29, HLA-ABC, e CD13, e negativo marcadores, tais como CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19, e PDPN. A funcionalidade dos hMSCs foi ainda verificada por diferenciação em relação aos condrócitos, adipócitos e osteoblastos. Os osteoblastos, condrócitos e adipócitos derivados de hMSCs foram caracterizados pela coloração de von Kosa (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., EUA) e coloração da osteocalcina (indicando osteogénese), azul de toluidina (T3260, Sigma) e coloração aggrecana (indicando condrogénese), e coloração vermelho de óleo (O1391, Sigma) (indicando adipogénese) de acordo com as instruções do fabricante.

isolamento e cultura dos hMSCs primários

os Hmsc primários foram isolados da gingiva de diferentes indivíduos.23,33,34,65 os tecidos separados da gingiva foram cortados em pequenos pedaços (1 mm2) usando tesouras na enzima TrypLE™ Express (1 ×) mais Dispase IV e incubados a 37 °C durante 30 minutos. As suspensões de tecidos digeridos foram neutralizadas pelo meio de cultura MSC e centrifugadas a 200 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Os pellets resultantes foram ressuspendidos em meio de cultura MSC contendo MEMa (Invitrogen) complementados com 10% de FBS (Gibco), 1 ng/mL de bFGF, e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) e banhados em placas revestidas de gelatina para o crescimento de hMSCs primários.

Luciferase reporter assay

the PER2-dLuc plasmid was a kind gift from E. E. Zhang.88 células abrigando PER2-dLuc foram cultivadas para confluência em placas de 24 poços e sincronizadas com 20 µM forskolin (S2449, Selleck) por 2 h. O meio foi então substituído por meio de cultura MSC contendo 0,25 mM luciferina (LUCK-1G, GoldBio). As células foram monitoradas em um luminômetro de Lumiciclo a 37 ° C por 5-7 dias; os dados gerados foram analisados com software de Análise de Lumiciclo (Actimetria). Os dados do primeiro ciclo de 24 horas foram excluídos da nossa análise estatística.

in vitro, a sincronização e análise circadiana de hMSC

hMSCs foram revestidas com placas revestidas de gelatina com meio MSC até 95% de confluência. Para a sincronização, as células foram então tratadas com forskolin de 20 µM durante 2 h e re-armazenadas em meio MSC após lavagem duas vezes com PBS. As células foram recolhidas a partir de 24 horas após a sincronização em intervalos de 3-h durante 9 pontos temporais, seguidas por extracção de ARN e detecção de RT-qPCR. O teste não parametrico JTK_CYCLE foi usado para verificar oscilações circadianas como descrito anteriormente.89 linhas de hmscs com valores de P E q < 0, 05 foram consideradas rítmicas.

Western blotting

Cells were lysed in SDS buffer containing 4% SDS and 100mM Tris-HCl. A concentração de proteínas foi quantificada utilizando um kit de quantificação BCA (Thermo Fisher Scientific), e ~20 µg de proteína por amostra foi submetida a SDS-PAGE e electrotransferida a membranas PVDF (Millipore). Em seguida, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite, e incubadas com anticorpos primários e, em seguida, com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP). Bandas imunoreativas foram visualizadas em um sistema ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). As análises estatísticas foram quantificadas pela Image J software (NIH). Cada grupo tinha três experiências independentes. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado.

Transmission electron microscopy

Late-passage (P9) CLOCK+/+ and CLOCK−/− hMSCs were harvested enzymatically with TrypLE (Thermo Fisher Scientific) and centrifuged at 500 × g for 5 min at room temperature. Os pellets resultantes foram fixados com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS (pH 7.4) sobre gelo durante a noite. As células foram posteriormente desidratadas em uma série graduada de etanóis, permeabilizadas e incorporadas em resina de Lowicryl HM20. As secções (200 nm) foram obtidas e fotografadas com um microscópio electrónico de transmissão de Espirito (FEI Company) a funcionar a 100 kV.

coloração da imunofluorescência

as células semeadas em coberturas (Thermo Fisher Scientific) foram lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram fixadas com 4% de PFA durante 30 minutos, permeabilizadas com 0, 4% de Triton X-100 em PBS durante 30 minutos e bloqueadas com 10% de soro de burro em PBS (Jackson Immuno Research) durante 1 h à temperatura ambiente. Após o bloqueio, As células foram incubadas com anticorpos primários a 4 °C durante a noite. Subsequentemente, as células foram lavadas três vezes com PBS, incubadas com anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 1 h e lavadas três vezes com PBS. Os núcleos foram manchados com Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). A imagem foi realizada com um sistema confocal Leica SP5. A análise estatística do número, intensidade e área dos sinais de fluorescência foi quantificada pela Image J software (NIH). As células foram recolhidas de três replicados biológicos. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado. The 3D reconstruction of H3K9me3 staining as shown in Fig. 2f foi realizado por Serial z-stack em intervalos de 50 nm em um modo convencional para até 50 imagens com um sistema confocal Leica SP5 e posteriormente processado para reconstrução 3D pela Imaris software (Versão 7.4.2), Como anteriormente descrito.90

sa-β-gal Staining assay

SA-β-gal staining foi realizado como descrito em estudos anteriores.Em resumo, 33,34 células foram fixadas com tampão de fixação (2% de formaldeído e 0.2% de glutaraldeído) durante 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células fixas foram manchadas com solução de coloração fresca a 37 °C durante a noite. Campos de visão foram selecionados aleatoriamente em cada poço, e a porcentagem de células SA-β-gal-positivas foi determinada usando software ImageJ. Cada grupo tinha três replicados biológicos. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado.Foi conduzido um doseamento de expansão clonal,tal como anteriormente relatado.34,65 em resumo, 6000 células por poço foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 9-12 dias. As células foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de PFA e manchadas com 0, 2% de violeta cristal durante 1 h à temperatura ambiente. Os campos de visão foram digitalizados por um scanner e posteriormente medidos pela ImageJ software (NIH). Cada grupo tinha três replicados biológicos. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado.

Co-IP

HEK293T células transfectadas com plasmídeos expressando Flag-Luc ou Flag-CLOCK e hMSCs foram lisados em tampão de lise da parte inferior (120 mM NaCl, 0.3% de caps, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7, 5) e cocktail completo de inibidores da protease (Roche) a 4 °C durante 4 h E foram depois centrifugados a 14,500 × g a 4 °C durante 40 minutos. Para Co-IP com proteínas exógenas, o sobrenadante foram misturadas com o anti-Flag de anticorpos-juntamente esferas (A2220, Sigma) e rodado durante a noite a 4 °C. Para a Co-IP com proteínas endógenas, o sobrenadante foram misturados com o indicado anticorpos durante a noite a 4 °C com rotação e, em seguida, foram incubadas com Proteína/G-PLUS esferas de Agarose (sc-2003, Santa Cruz) por mais 4 h a 4 °C com rotação. As contas foram lavadas seis vezes com tampão de caps e depois eluídas com peptídeos de bandeira ou por ebulição em tampão de carregamento de 1× SDS durante 10 minutos para western blotting.

LC-MS/MS analysis and protein identification

The eluted proteins obtained by immunoprecipitation were subjected to 10% SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). As bandas de gel que contêm as amostras de proteínas foram excisadas, cortadas em tampas pequenas, desidratadas (100% acetonitrilo), reduzidas (10 mM TDT em 25 mM NH4HCO3 para 45 minutos a 56 °C) e alquiladas (40 mM iodoacetamida em 25 mM NH4HCO3 para 45 minutos à temperatura ambiente no escuro). Em seguida, as tampas de gel foram secas e digeridas com tripsina modificada sequenciada (40 ng por banda) em 25 mM NH4HCO3 durante a noite a 37 °C. finalmente, o ácido fórmico a uma concentração final de 1% foi usado para terminar a reação enzimática. A solução resultante foi então transferida para um frasco de amostra para análise CL-MS/MS.

os experimentos nanoLC-MS/MS foram realizados em um espectrômetro de massa Q exato (termo científico) em modo dependente de dados, o que permitiu a aquisição de dados MS em uma alta resolução de 70.000 (m/z 200) em um intervalo m/z de 300-1,600. Os dados brutos da análise exata Q foram analisados com a descoberta do Proteoma (versão 1.4) usando o motor de busca ht sequente para identificação de proteínas e Percolador para a análise da taxa de descoberta falsa (FDR). Os dados foram pesquisados na Base de dados da proteína humana UniProt (atualizada em 06-2013). A análise do FDR foi realizada com o Percolador, e o FDR < 1% foi definido como o limiar para a identificação das proteínas. A confiança do peptídeo foi elevada para filtragem do peptídeo.

RT-qPCR e RNA-Seq

o RNA Total foi extraído de culturas de células humanas ou articulações de ratos usando TRIzol (Thermo Fisher Scientific), e o ADN genómico foi removido utilizando um kit sem ADN (Thermo Fisher Scientific). o cDNA foi gerado com o Go Script Reverse Transcription System (Promega). RT-qPCR foi realizado usando qPCR Mix (Toyobo) em um sistema CFX384 em tempo Real (Bio-Rad). Cada grupo tinha quatro réplicas. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado. Todos os experimentos RT-qPCR foram realizados com pelo menos três replicados experimentais e independentemente repetidos por pelo menos duas vezes. Para as articulações RNA-seq do rato, as amostras de RNA da articulação do joelho do mesmo grupo de tratamento de ratinhos idosos injectadas com lentivírus que expressam Luc (n = 12 ratinhos) ou CLOCK (n = 12 ratinhos) foram misturadas igualmente em massa, e RNA-seq foi realizado com duas réplicas técnicas. Para HMSC RNA-seq, duas réplicas biológicas foram examinadas. Uma biblioteca de sequenciamento foi construída usando um kit de Preparação da Biblioteca NEBNext Ultra RNA para ilumina seguindo o protocolo do fabricante. As bibliotecas geradas foram sequenciadas em plataformas Illumina HiSeq X-Ten com sequenciação emparelhada com comprimentos de leitura de 150-bp. O controle de qualidade e a sequenciação foram realizados pela tecnologia de Bioinformática do gene NoVo. Os iniciadores utilizados para qPCR foram apresentados na informação suplementar, quadro S2.

RNA-seq data processing

The RNA-seq data processing pipeline has been reported previously.34 leituras Raw emparelhadas foram aparadas em “Trim Galore software” (versão 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Leituras limpas foram mapeadas para o genoma humano HG19 da UCSC ou o genoma MM10 do mouse usando o hisat2 (versão 2.0.4).91 os arquivos sam foram convertidos para arquivos bam por SAMtools com o parâmetro “- S-b-q 10”.92 então, as contagens de leitura foram calculadas pelo HTSeq (versão 0.11.0), e apenas leituras mapeadas de alta qualidade (Qualidade de mapeamento > 20) foram mantidas.93 O valor dos fragmentos por Quilobase por milhão (FPKM) para cada gene foi calculado usando StringTie (versão 1.2.3).94 genes de expressão diferente (DEGs) foram calculados usando o pacote DESeq2 (versão 1.22.2) com o corte “q valor (valor p ajustado, padj) < 0.05 e |log2 (alteração da dobra)| > 1 para hMSCs ou |log2 (alteração da dobra)| > 0.5 para juntas de rato”. A análise de enriquecimento por Ontologia genética (GO) foi conduzida com ToppGene.A análise do enriquecimento de conjunto genético foi efectuada pela GSEA (versão 2.2.4). O conjunto de genes SASP foi obtido de um estudo anterior.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam and pLgw EcoDam-V5-EMD were gifts from Prof. Bas van Steensel (The Netherlands Cancer Institute (NKI)). DamID-seq foi realizado como descrito,58 com modificações. Em resumo, os lentivírus Dam e Dam-EMD gerados a partir das células HEK293T foram concentrados por ultracentrifugação a 19.400× g para 2,5 h. Os pellets do vírus foram ressuspendidos em PBS. CLOCK+/+ e CLOCK− / − hMSCs foram semeados em pratos de seis poços a 2 × 105 células por Poço. Cada grupo tinha três replicados biológicos. No dia seguinte, o meio de cultura foi substituído por 2 mL de meio de cultura fresco contendo lentivírus Dam ou Dam-EMD. Às 72 horas após a transdução, as células foram colhidas, e o DNA genômico foi isolado usando um kit de tecido Pneasy & (69504, Qiagen). DpnI (R0176S, New England Biolabs) digestão, ligação adaptadora, DpnII (R0543S, New England Biolabs) digestão, amplificação PCR e purificação foram realizadas como descrito anteriormente.58 For adapter trimming, the amplified DNA was sonicated and digested with AlwI (R0513S, New England Biolabs). A biblioteca de DNA foi construída usando um kit NEBNext Ultra DNA Library Prep para Illumina (E7370S, New England Biolabs). As bibliotecas foram agrupadas e submetidas a sequenciação emparelhada com comprimentos de leitura de 150 bp em sequenciadores ilumina NovaSeq.

DamID-seq data processing

Raw reads of Dam and Dam-EMD data for CLOCK+ / + and CLOCK – / – hMSCs were Trimm Galore software (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Leituras aparadas foram mapeadas para o genoma humano HG19 UCSC usando Bowtie 2 (Versão 2.2.9).96 duplicados PCR foram removidos com o MarkDuplicates.programa jar em Ferramentas Picard. Em seguida, as leituras foram ordenadas com SAMtools (versão 1.6). Para minimizar o efeito de polarização sequenciada e profundidade, leituras processadas de três replicados para cada amostra foram fundidas. Em seguida, o mesmo número (110 milhões) de leituras de alta qualidade para cada tipo de célula foram selecionados aleatoriamente para análise a jusante. Para visualizar os sinais DamID, calculamos a razão log2 das leituras por Quilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM) dos sinais Dam-EMD e Dam (log2 (Dam-EMD/Dam) no CLOCK+/+ e CLOCK−/− hMSCs para cada bin de 10-bp usando o programa bamCompare no software deepTools (versão 2.5.4-2-5e467f).

Para a identificação do RAPAZ regiões no RELÓGIO+/+ e RELÓGIO−/− hMSCs, primeiramente, foi calculado o DamID sinais (log2 relação entre o RPKM da Barragem-EMD e Barragem de sinais (log2 (Dam-EMD/Dam)) no RELÓGIO+/+ e RELÓGIO−/− hMSCs para cada 2 kb bin usando o bamCompare programa em deepTools (versão 2.5.4-2-5ee467f) de software. Em seguida, implementamos o pacote R para modelos escondidos Markov com emissões t (HMMt) (Versão 0.1), para identificar os rapazes (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

Para comparar o DamID sinais RAPAZ entre regiões RELÓGIO+/+ e RELÓGIO−/− hMSCs, nós fundimos RAPAZ regiões identificadas no RELÓGIO+/+ e RELÓGIO−/− hMSCs em união e calculado o relativo DamID sinal (DamID sinal de RELÓGIO−/− hMSCs menos DamID sinal de RELÓGIO+/+ hMSCs) para cada união RAPAZ região. Em seguida, os sinais DamID relativos para as regiões LAD foram traçados usando R pacote RIdeogram (versão 0.2.2), como mostrado na informação suplementar, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR e ChIP-seq

in brief, 1 × 106 CLOCK+ / + and CLOCK – / – hMSCs were crosslinked in 1% (vol/vol) formaldeído in PBS for 8 min at room temperature, and the reaction was terminated by incubation with 125 mM glycine for 5 min at room temperature. As amostras foram então lisadas em gelo por mais 10 minutos. Após sonicação em Covaris S220 concentrou-ultrasonicator (Covaris) e centrifugação por 10 min a 12.000 x g a 4 °C, o sobrenadante foram incubadas overnight a 4 °C com Proteína Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004D) conjugado com um anti-RELÓGIO de anticorpos anti-H3K9me3 ou de anticorpos IgG de coelho. Subsequentemente, a eluição e o cruzamento inverso foram realizados a 68 °C durante 2 h num termomixador. Depois, o ADN foi isolado por extracção de álcool fenol-clorofórmio-isoamílico e precipitação de etanol. O DNA purificado foi submetido a qPCR para a avaliação da ocupação do relógio ou h3k9me3 em sequências repetitivas. Os fragmentos enriquecidos foram construídos em bibliotecas sem a incorporação de controles spike-in via Kapa Hyper Prep Kits com PCR Library Amplification / Illumina Series (KK8504, New England Biolabs) seguindo as instruções do fabricante. Todas as experiências foram realizadas pelo menos duas vezes com resultados semelhantes. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado.

processamento de dados de ChIP-seq

para o processamento de dados de ChIP-seq H3K9me3, as leituras em bruto foram aparadas com software Trim Galore (versão 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Leituras aparadas foram mapeadas para o genoma humano HG19 UCSC usando Bowtie 2 (Versão 2.2.9).96 leituras duplicadas foram removidas com o MarkDuplicates.programa jar em Ferramentas Picard. Em seguida, as leituras foram ordenadas com SAMtools (versão 1.6). Para minimizar o efeito de polarização sequenciada e profundidade, leituras processadas de três replicados para cada amostra foram fundidas. Em seguida, o mesmo número (130 milhões) de leituras de alta qualidade para cada tipo de célula foram selecionados aleatoriamente para análise a jusante. Para visualizar os sinais ChIP-seq, calculamos as contagens de leitura normalizadas determinando os valores RPKM para cada bin de 10-bp. Para a chamada de pico H3K9me3, o SICER (versão V1.1) foi usado com o parâmetro “-w 200-g 3”.98 só foram mantidos picos chamados de h3k9me3 com um FDR de corte igual ou superior a 1%.

para a identificação das “montanhas H3K9me3”, o sinal H3K9me3 em contagens por milhão (CPM) em cada pico H3K9me3 foi calculado. Em seguida, classificamos os picos H3K9me3 na ordem de aumentar o sinal H3K9me3 e plotou o ChIP h3k9me3-seq de ocupação no CLOCK+/+ e CLOCK− / − hMSCs, como mostrado na informação suplementar, Fig. S4F. estas parcelas mostraram um ponto claro onde o sinal de ocupação H3K9me3 começou a aumentar rapidamente. Em seguida, os pontos de inflexão dessas curvas foram determinados. Definimos ainda picos de h3k9me3 acima dos pontos de inflexão como “montanhas H3K9me3” e picos de H3K9me3 abaixo desses pontos como picos típicos de h3k9me3.

ATAC-seq

ATAC-seq foi realizado como descrito anteriormente.Em resumo, um total de 50 000 células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspendidas em 50 µL de tampão de lise [10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) substituto de Nonidet P40]. A suspensão de núcleos foi então centrifugada a 500 × g durante 10 minutos a 4 °c, seguida pela adição de 50 µL de mistura de reação de transposição (10 µL de tampão 5 × TTBL, 4 µL de mistura de TTE e 36 µL de H2O livre de nucleases) a partir de um kit de Preparação para a biblioteca de ADN Trueprepép V2 para a ilumina (Vazyme Biotech). As amostras foram então incubadas a 37 ° C durante 30 minutos. As bibliotecas foram então amplificadas e purificadas usando o Kit de Preparação da biblioteca de DNA TruePrep V2 para Illumina (Vazyme Biotech). A qualidade da Biblioteca foi avaliada usando um analisador de fragmentos. Finalmente, as bibliotecas foram sequenciadas em plataformas Illumina HiSeq X-Ten com sequenciação emparelhada com comprimentos de leitura de 150-bp.

ATAC-seq data processing

For the processing of ATAC-seq data, raw reads were trimmed with Trim Galore software (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Leituras aparadas foram mapeadas para o genoma humano HG19 da UCSC usando Bowtie 2 (Versão 2.2.9) com o parâmetro “- X 2000-n 1-L 25-no –mixed-no-discordant-t”.96 leituras duplicadas foram removidas com a marcação.programa jar em Ferramentas Picard. Em seguida, as leituras foram ordenadas com o software SAMtools (versão 1.6). Em seguida, leituras processadas de três replicados para cada amostra foram fundidos. Para visualizar os sinais de ATAC, estendemos cada leitura por 250 bp e normalizamos as contagens de leitura pelo valor de RPKM para cada bin de 10-bp. Para ATAC peak calling, MACS2 (versão 2.1.1.20160309) foi usado com o parâmetro “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits”.Apenas foram mantidos os picos do ATAC com valores q < 0,01. Os picos do ATAC identificados no CLOCK+ / + mas não no CLOCK – / – hMSCs foram definidos como picos do ATAC” fechados”; os picos do ATAC identificados no CLOCK−/− mas não no CLOCK+/+ hMSCs foram definidos como picos do ATAC” abertos”. Estimativa da distribuição genómica dos picos de ATAC utilizados annotatePeaks.pl programa no programa homer.101

avaliação da reprodutibilidade dos dados de sequenciação

para avaliar a reprodutibilidade dos dados H3K9me3 ChIP-seq e ATAC-seq, a distância euclidiana entre replicados foi calculada do seguinte modo:: as leituras foram contadas e normalizadas pelo RPKM em um tamanho de bin de 2 kb. Em seguida, a distância Euclidiana foi calculada em R (versão 3.5.1) para avaliar a reprodutibilidade. Distâncias euclidianas mais baixas significam correlações mais altas. Para avaliar a reprodutibilidade dos dados DamID-seq, a principal Análise de componentes (PCA) foi realizada em R (versão 3.5.1). Para avaliar a reprodutibilidade dos dados RNA-seq, as parcelas de dispersão foram desenhadas com base no logaritmo regularizado (rlog)-a contagem de leitura normalizada com DESeq2, e o coeficiente de correlação de Pearson entre replicados foi calculado.

Animal experiments

For teratoma formation analysis, NOD/SCID mice (6-8 weeks old, purchased from Beijing Vital River Animal Technologies Co. Ltd) foram injetados com 3 × 106 CLOCK+/+ ou CLOCK− / − hESCs em uma solução Matrigel: mTeSR (1:4). Os Teratomas foram colhidos 8 a 12 semanas após a injecção para análise posterior.

para os ensaios de transplantação de hMSC, 1 × 106 CLOCK+/+ ou CLOCK− / − hMSCs transduced with Lentivirus expressing Luc were injected into the TA muscle of nude mice (6-8 weeks old). Os ratos foram então tratados com D-luciferina (LUCK-1G, GoldBio) e fotografados com um sistema de imagem do espectro IVIS (Xenogen, Caliber, Waltham, MA, EUA). Imagens de bioluminescência foram adquiridas no modo “auto”. Cada grupo tinha seis réplicas biológicas. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado.

For the aging-associated Clock level detection, mice of different ages (young, 1 month, n = 5 mice; old, 15 months, n = 10 mice) were eutanized and the joints were collected for RT-qPCR analysis. Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado.

Para avaliar se lentivirus de administração do RELÓGIO poderia aliviar o envelhecimento relacionados a síndromes, lentiviruses expressar Luc (n = 14 ratos) ou RELÓGIO (n = 13 ratos) foram injetados nas cavidades articulares de 18 meses de idade, os ratos (adquirido a partir de SPF (Pequim) Biotecnologia) e repostos após 8 semanas de injeção. A experiência de Esteira foi realizada 15 semanas após a primeira injecção de lentivírus expressando Luc ou CLOCK. Em detalhe, os ratos foram treinados em uma passadeira (SA101, SANS) em uma inclinação de 5° durante 3 dias durante 20 minutos por dia, com a velocidade acelerada de 0 a 20 m/min. No dia do teste, os ratos correram na passadeira com uma velocidade inicial de 0 m/min, e então a velocidade foi aumentada em 2 m/min para 20 m/min. O tempo de execução foi fixado em 20 minutos. A frequência do estímulo de choque elétrico leve foi registrada e analisada (Luc, n = 14 ratos; CLOCK, n = 13 ratos). A digitalização Micro-CT foi realizada às 16 semanas após a primeira injecção (Luc, n = 14 ratinhos; CLOCK, n = 13 ratinhos). Os ratos foram então eutanasiados e as articulações foram recolhidas para avaliação histológica (Luc, n = 14 ratinhos; CLOCK, n = 13 ratinhos) e quantificação do mRNA (Luc, n = 12 ratinhos; CLOCK, n = 12 ratinhos). Os significados estatísticos foram avaliados por um teste t de um estudante de duas caudas não emparelhado.

Histologia e imunohistoquímica

para análise histológica, as articulações colhidas no rato foram fixadas com 4% de PFA durante 2 dias e incorporadas na parafina após descalcificação durante 14 a 21 dias. As secções (5 µm) foram manchadas com FCF Verde rápida (0,02%) e safranina O (0.1%) de acordo com as instruções do fabricante.

a coloração imunohistoquímica foi realizada usando o método de coloração DAB como descrito anteriormente, com algumas modificações.Em primeiro lugar, 33,34,102, os diapositivos foram desparafinizados e rehidratados utilizando xileno e diferentes concentrações de álcool. A recuperação do antigénio foi realizada utilizando a digestão de Tripsin (ZLI-9010, ZSGB-BIO) durante 20 minutos à temperatura ambiente. O peróxido de hidrogénio (3%) foi utilizado para bloquear a actividade endógena da peroxidase, incubando durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lâminas foram então bloqueado com 10% de burro soro por 1 h em temperatura ambiente e incubadas com anti-P16 anticorpo (Ab54210, Abcam, 1:200), a 4 °C durante a noite e com um anticorpo secundário (PV-6002, ZSGB-BIO) por 1 h à temperatura ambiente antes de coloração DAB (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

Éticos declarações

Os experimentos envolvidos neste estudo seguiu os Princípios para o Formato de Aplicativo para Aprovação Ética de Pesquisas Envolvendo Animais e foram aprovados, previamente, pelo Institucionais de cuidados com Animais e Usar o Comitê do Instituto de Zoologia (Academia Chinesa de Ciências). A anestesização de ratinhos foi realizada com Isoflurano e a eutanização foi realizada com CO2 seguido de luxação cervical.

análise estatística

análises estatísticas foram realizadas usando software Prism Graph-Pad. Os dados são apresentados como médias ± SEM ou SD. Comparações foram realizadas com o teste t do estudante de duas caudas não emparelhado. O valor de P (p) < 0, 05 foi definido como estatisticamente significativo.