Constitutivo da expressão de genes selecionados a partir da pentose fosfato e aromáticos vias aumenta o ácido chiquímico rendimento em alta de glicose no lote de culturas de Escherichia coli cepa falta de PTS e pykF | Célula Microbiana Fábricas

Construção de linhagens derivadas de PB12 aroK-aroL- contendo um plasmídeo projetado para a expressão constitutiva de um sintético operon usado na produção de o ácido chiquímico
Avaliação dos efeitos causados pela pykF inativação em estirpes de expressar o Aro6 operon
perfis de fermentação de AR36 em culturas de lotes
Insights sobre o glycolytic e acetato de metabolismos de tensão AR36 por RT-de acordo com pcr

Construção de linhagens derivadas de PB12 aroK-aroL- contendo um plasmídeo projetado para a expressão constitutiva de um sintético operon usado na produção de o ácido chiquímico

Inédito evidência do nosso laboratório indica que a produção de compostos aromáticos em laboratório, evoluíram de deformação PB12 pode atingir níveis mais elevados quando a indução transcricional de genes envolvidos na canalizar fluxo de carbono para a AAA caminho ocorre no início da fermentação. Tendo em conta esta observação, foi desenvolvida uma nova estratégia para optimizar a produção de SA no PB12 que transporta genes aroK e aroL inactivos (Figura 1). Esta estratégia incluía a concepção e construção de um plasmídeo para a expressão forte e estável de seis genes-chave dispostos sob a forma de um operão sintético, controlado exclusivamente por um único promotor Trc. A fim de reduzir a carga metabólica, um único plasmídeo derivados de pBR327 carregando a par locus para o aumento da estabilidade do plasmídeo foi utilizado como vetor , após a incorporação de um fragmento contendo o promotor, polylinker, e terminadores de transcrição de pTrc99A (Figura 2).

A parte inicial do operon foi construído pela amplificação seqüencial e ligadura dos primeiros 4 sequências codificantes (aroB, tktA, aroGfbr, e aroE) para o polylinker do plasmídeo pBRINT-Ts Cm, usado como uma clonagem do andaime (ver Métodos). Mais tarde, a construção de 4 genes foi transferida para o plasmídeo híbrido pTrc327par em conjunto com mais 2 genes (aroD e zwf), levando a um operão de 8Kb contido num plasmídeo de 12Kb (Figura 2). O plasmídeo resultante, denominado pTrcAro6, foi transformado na estirpe PB12 aroK-arol desprovida do gene lacIq, permitindo a expressão constitutiva dos genes de interesse (Tabela 1). Por uma questão de simplicidade, a estirpe gerada PB12 aroK-arol-lacI foi denominada AR2. Após o gene pykF ter sido inactivado em AR2, a estirpe resultante foi denominada AR3. As estirpes derivadas de AR2 e AR3 que transportavam plasmídeos pTrcAro6 foram designadas, respectivamente, AR26 e AR36 (Quadro 1).

Tabela 1 Escherichia coli, cepas e plasmídeos utilizados neste relatório

O arranjo espacial das seqüências de codificação que constituem o sintético operon em pTrcAro6, ladeado pela Trc promotores e terminadores de transcrição, é mostrado na Figura 2. aroB é o primeiro gene do operão, uma vez que várias evidências indicam que sua baixa expressão é um dos passos limitantes na produção de compostos aromáticos . O plasmídeo pTrcAro6 também carrega os genes tktA e aroGfbr, cujos produtos estão envolvidos na síntese E4P e sua condensação com PEP para formar DAHP, o primeiro composto aromático (Figura 1). genes aroD e aroE também foram incluídos para promover uma conversão eficiente de DHQ para SA. Adicionalmente, este plasmídeo carrega o gene zwf, codificando para a primeira enzima do PPP (Figura 1). A decisão de incluir este gene baseou – se nas seguintes observações:: 1) a sobreexpressão de zwf substancialmente recuperada a taxa de crescimento da perda devido ao plasmídeo metabólica de carga na tensão JM101 crescendo em glicose como única fonte de carbono ; 2) tem sido relatado que a tensão PB12 exibe um especial de baixo carbono fluxo de partição em glicose 6-fosfato (G6P) nó para o PPP (5% do consumido G6P comparação com 22% da estirpe parental JM101) . Portanto, uma sobreexpressão deste gene deve aumentar a disponibilidade do NADPH, necessária em quantidades catalíticas pela enzima shikimate desidrogenase (AroE), e pode aliviar as afetações de crescimento potencial redirecionando mais G6P para nucleótido e biossíntese de aminoácidos em estirpes derivadas do PB12 . No entanto, as experiências apresentadas neste relatório não visavam dissecar o efeito específico de qualquer gene utilizado, mas sim caracterizar as consequências de expressar todos eles como um operão.

a fim de promover uma tradução eficiente de cada gene, cada sequência de codificação foi amplificada usando iniciadores designados que introduziram uma sequência de consenso Shine-Dalgarno localizado 8 bp a montante do local de início da tradução. A sequência nucleotídica do operão construído é apresentada no arquivo adicional 1.

Avaliação dos efeitos causados pela pykF inativação em estirpes de expressar o Aro6 operon

Para avaliar os efeitos causados pela pykF inativação na produção de SA, o desempenho da produção de cepas de AR26 (pykF+) e AR36 (pykF-) foi comparada usando agitar frascos contendo 15 g/L de Glc e 5 g/L de VÓS. Como um controle, as mesmas estirpes contendo um plasmídeo pTrc327par vazio (sem o operão Aro6), AR2e e AR3e, também foram incluídas.

apesar de A SA ter sido acumulada em todos os casos, como previsto para os mutantes em aroK e aroL, as estirpes contendo pTrcAro6 atingiram concentrações SA mais elevadas do que as que tinham um plasmídeo vazio (figura 3b). Além disso, o título SA foi quase duas vezes mais elevado em AR36 do que em AR26 (6, 1 g/L vs. 3, 3 g/L). Observou-se uma diminuição do consumo de Glc na estirpe AR26 após aproximadamente 18 h de cultura, correlacionando-se com uma elevada concentração de acetato e uma paragem na produção de SA. Em contraste, a estirpe AR36 exibiu consumo constante de Glc e quantidades negligenciáveis de acetato foram produzidas (figura 3c, 3d). Estes resultados demonstram que os genes presentes no operão artificial são funcionais e promovem a produção de SA Desde o início da cultura. A sua expressão constitutiva diminuiu a taxa de crescimento específico (μ) em 25% no fundo pykF+ e aumentou – a marginalmente na variante pykF, mas não causou alterações significativas na biomassa máxima produzida (Xmax) em comparação com estirpes com um plasmídeo vazio (figura 3a). Notavelmente, nas estirpes de expressão de operon nestas condições de crescimento, a inactivação do gene pykF aumentou a produção de SA, eliminou a acumulação de acetato e permitiu o consumo estável de Glc.

Para determinar se o maior acetato de produção e menor SA produção em AR26 comparado com AR36 é uma consequência da inerentemente baixa disponibilidade de oxigênio e a acidificação do meio em agitar frasco de culturas, ambas as linhagens foram cultivadas em 1 L de lote fermentadores, sob condições controladas de pH e oxigênio dissolvido tensão (PONTO). Como uma abordagem para aumentar o título SA, a concentração inicial de Glc nestas experiências foi aumentada para 100 g/L, e a concentração YE foi aumentada concomitantemente para 15 g/L para permitir a geração de biomassa mais elevada.

nestas condições, a estirpe AR36 produziu 42 g/L de SA em 60 h, consumindo toda a Glc e acumulando 12 g / L de acetato. Em contrapartida, após 47 h, a estirpe AR26 produziu um máximo de 13 g / L de SA, não esgotou o Glc e acumulou 29 g/L de acetato (figura 3e e quadro 2). Independentemente das condições controladas nos fermentadores, onde o pH era mantido em 7 e o ponto era superior a 20% em todos os momentos, os perfis de produção de ambas as estirpes assemelhavam-se ao comportamento observado nos frascos agitados, com AR26 produzindo mais acetato e Menos SA. Mesmo quando a taxa global volumétrica de consumo de Glc (Qsglobal), μ e Xmax alcançada por ambas as estirpes eram semelhantes, a produtividade, rendimento e título eram mais do dobro em AR36 do que em AR26 (figura 3e e quadro 2).

Tabela 2 dados Comparativos a partir de 1 L de lote de fermentação de cepas AR26 e AR36, usando 100 g/L de Glc e 15 g/L de VÓS como substratos

é notável que tais diferenças grandes em acetato e SA de produção foram observados por interromper um só gene, o que demonstra as vantagens da combinação de inactivação de PTS e pykF quando usando uma expressão constitutiva do sistema em evolução E. coli cepa. Para explicar as melhorias observadas na produção de SA, sugerimos que a expressão precoce e constante das enzimas codificadas no operando poderia manter um consumo constante de intermediários glicolíticos em todas as culturas, evitando altas flutuações nas suas concentrações intracelulares. Nós hipotetizamos que a combinação deste estado metabólico estacionário com um fluxo reduzido de PEP para piruvato causado pela inactivação do gene pykF pode aumentar a disponibilidade de PEP e outros precursores glicolíticos para a produção SA sem diminuir a taxa de consumo de Glc. No entanto, reconhecemos que, na ausência de concentrações medidas de metabolito intracelular, estas observações são especulativas.

perfis de fermentação de AR36 em culturas de lotes

tendo em conta os resultados anteriores, AR36 foi selecionado para posterior caracterização do seu desempenho cinético e estequiométrico em fermentadores de 1 L. Para alcançar tal objetivo, a produção de SA foi testada com três condições de cultura de alto substrato diferentes. Crescimento, Glc e subprodutos foram medidos para cada caso, o que por sua vez permitiu uma comparação das produtividades e rendimentos.Em primeiro lugar, foram utilizados 50 g/L de Glc e 15 g/L de YE (figura 4a). O crescimento ocorreu durante os primeiros 10 h, gerando 6, 3 g/L de peso da célula seca com um μ de 0, 53 h-1. Nesta condição, 24 g / L de SA foram produzidos em 32 h. O consumo de Glc e a produção de SA ocorreram desde o início da fermentação e duraram até ao esgotamento de Glc, embora a taxa de consumo específica de Glc (qs) e a produtividade específica de SA (qp) fossem mais elevadas na fase exponencial (Quadro 3). O rendimento resultante da SA em Glc (YSA/Glc) foi de 0,47 mol/mol e a produtividade global volumétrica da SA (Qpglobal) foi de 0.74 gSA / L*h (quadro 3). No que respeita à acumulação de subprodutos na via SA, estavam presentes no sobrenadante concentrações de 2,4 g/L de DAHP, 2,1 g/L de DHS, 1,4 g/L de QA, 0,4 g/L de GA e 0,3 g/L de DHQ no final da fermentação (figura 5a). Nestas condições, praticamente não foi produzido acetato durante a fermentação, atingindo uma concentração máxima de 1,5 g/L após 32 h (figura 4a).

Tabela 3 Comparação da medida de metabólitos e calculado cinética e estequiométrica parâmetros entre três fermentações de tensão AR36 com diferentes concentrações de substrato

Considerando que 50 g/L de Glc foram consumidos completamente, um segundo lote experimento foi iniciado com 100 g/L de Glc e 15 g/L de VÓS. Tal como referido na comparação com o AR26 na secção anterior, o AR36 cultivado nestas condições produziu cerca de 42 g/L de SA em 60 h (figura 4b). Neste caso, após consumir cerca de 100 g/L de glucose e atingir a concentração máxima de SA, a estirpe produziu 12 g/L de acetato. Os valores obtidos para YSA / Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax e μ, foram semelhantes aos obtidos com 50 g/L de Glc e 15 g/L de YE (Quadro 3). Estes experimentos mostram que ao usar a mesma concentração de YE, duas vezes a quantidade de Glc é consumida em quase duas vezes o tempo, indicando que a taxa média de consumo de glicose é mantida entre ambas as condições de cultura. Concentrações de 4, 8 g/L de DAHP, 2, 8 g/L de DHS, 3, 4 g / L de QA, 0.7 g/L de GA e 0,9 g / L de DHQ estiveram presentes no sobrenadante após 60 h (figura 5b). Curiosamente, ao duplicar a concentração de Glc, os produtos intermédios da via AAA aumentaram de forma bastante proporcional com a SA, indicando que o consumo de 100 g/L de Glc aparentemente não gerava novos estrangulamentos do fluxo de carbono. Como resultado, a quantidade de SA formada em relação aos compostos aromáticos totais produzidos foi de cerca de 80% em ambos os experimentos (Figura 6).

O efeito de aumentar a VOS SA produtividade foi investigada com um terceiro conjunto de experimentos, utilizando 100 g/L de Glc e 30 g/L de VÓS. Embora a biomassa foi dobrada ao utilizar o dobro da concentração de VÓS, SA título, μ e YSA/Glc foram muito semelhantes aos obtidos na cultura com 100 g/L de Glc e 15 g/L de VÓS (Figura 4 e Figura 4c). Em conjunto com os dados obtidos a partir das outras duas condições, estes resultados sugerem que a quantidade de YE determina principalmente a biomassa máxima que pode ser alcançada. Além disso, um aumento na concentração inicial de YE não alterou o título SA e apoia a observação de que a SA está a ser produzida principalmente a partir da glucose. A relação directa entre a concentração inicial de YE e a biomassa máxima gerada, independentemente da concentração inicial de Glc testada nestas condições de crescimento, sugere que um ou mais nutrientes limitantes estão a ser fornecidos pelo YE. Também parece que tais nutrientes não podem ser sintetizados a partir de Glc, daí a sua diminuição do crescimento de YE limites muito antes de Glc estar esgotado. Espera-se que os aminoácidos aromáticos e as vitaminas presentes no YE que são necessários para neutralizar a auxotrofia AR36 se tornem limitantes; no entanto, outros compostos neste meio complexo podem também desempenhar um papel na limitação do crescimento ao longo do tempo.

Para uma partida VÓS concentração de 30 g/L, de um total de 106 g/L de Glc e 43 g/L de SA foram consumidos e produzidos, respectivamente, em cerca de metade do tempo de fermentação com 15 g/L de VÓS. Com 30 g / L de YE, o Qsglobal e o Qpglobal aumentaram para o dobro, em comparação com as fermentações com 15 g/L de YE, embora o título SA se tenha mantido inalterado (Quadro 3). Uma vez que a biomassa também aumentou para o dobro, o qp calculado e qs foram semelhantes entre os três experimentos, tanto em fases exponencial e estacionária, exibindo a robustez metabólica da estirpe projetada sob as condições testadas.

além disso, os resultados mostraram que um aumento na concentração do IE não aumentou consideravelmente a concentração dos intermediários da via SA (figura 5c). A este respeito, reconhece-se que a presença de quantidades elevadas de intermediários de Vias pode ter um impacto negativo na recuperação da SA do caldo de fermentação . Esta preocupação tem direcionado alguns esforços para o assunto, levando ao teste de condições de cultura, origens genéticas, e o uso de análogos de glicose não metabolizáveis, como tentativas de minimizar a geração de subprodutos .

nestes experimentos, uma alta proporção de SA em relação aos subprodutos foi detectada sem aplicar qualquer modificação adicional à estirpe ou processo. A concentração de cada via intermediária foi comparada com a soma de todos os intermediários aromáticos, e suas porcentagens foram usadas para calcular a razão molar de SA para cada subproduto no final das fermentações (Figura 6). A proporção de SA revelou-se superior a 10 para DHS, QA, ou DAHP e superior a 40 para GA ou DHQ para todas as concentrações de substrato testadas. Notavelmente, em todas as condições os rendimentos SA obtidos foram próximos de 50% do máximo teórico e os rendimentos dos compostos aromáticos totais (TAC) foram superiores a 60% do máximo teórico, estimado em 0.86 molTAC / molGlc (ver Métodos e Figura 6). Isto reflecte a reorientação eficiente da glucose para a via AAA na estirpe AR36, mesmo quando se utilizam culturas de lotes de elevada glucose. A relação entre a SA e os subprodutos, bem como os rendimentos obtidos da SA e do TAC, são relativamente constantes para todas as condições avaliadas e representam, tanto quanto sabemos, os valores mais elevados comunicados para um processo de fermentação da SA. Estas melhorias podem ser justificadas levando em conta que a plataforma presente na estirpe projetada permite uma expressão mais homogênea das enzimas necessárias em um fundo genético eficiente. Isto, em contraste com outros sistemas de expressão onde os genes necessários são expressos a partir de plasmídeos separados, sob diferentes promotores, ou em estirpes não optimizadas para uma utilização eficiente de elevados níveis de Glc. Além das vantagens relativas à dinâmica da expressão genética, o fato de que a IPTG não é necessária para induzir o operão Aro6 representa um importante benefício econômico para o processo de produção, uma vez que o alto preço da IPTG restringe seu uso em fermentações em larga escala.

Insights sobre o glycolytic e acetato de metabolismos de tensão AR36 por RT-de acordo com pcr

Para obter uma percepção mais profunda das alterações metabólicas induzidas pela expressão constitutiva do Aro6 sintético operon na deformação AR36, níveis de transcrição de vários genes foram medidos em três diferentes estágios de crescimento em culturas com 50 g/L de Glc e 15 g/L de VÓS. Conforme detalhado nos métodos, os dados obtidos a partir da fase exponencial inicial (EE), fase exponencial tardia (LE) e fase estacionária (ST) foram normalizados em relação aos valores medidos a partir da estirpe AR3e no EE, cultivados nas mesmas condições de cultura.

os resultados indicam que a presença e expressão do operão na estirpe AR36 aumenta os níveis transcritionais de vários genes que codificam enzimas glicolíticas durante as fases EE e LE (Figura 1 e figura 7a). O aumento da expressão de genes galP e glk é particularmente interessante porque tem sido relatado que seus produtos controlam a importação e fosforilação de glicose em PB12, a estirpe parental de AR36 . Além disso, verifica-se um aumento significativo dos níveis de transcrição da IGP e da eno, mas não da pykA. Estas alterações podem traduzir-se numa maior disponibilidade de PEP e frutose 6-P (que podem ser directamente convertidas em E4P pela transcetolase codificada por plasmídeos), aumentando a produção de compostos aromáticos. Nós teorizam que o observado upregulation de glycolytic genes na deformação AR36 poderia ser uma das consequências para os baixos níveis de alguns glycolytic intermediários (glicose 6-fosfato frutose 6-fosfato e PEP), causado pelo forte e constitutivo expressão do operon-codificado enzimas que consomem estes metabólitos.

por outro lado, os níveis de transcrição dos genes que codificam para enzimas envolvidas em acetato de biossíntese (poxB, ackA e pta) não foram modificadas pela presença do sintético operon, enquanto actP e acs, que codificam para enzimas envolvidas em acetato de assimilação, foram fortemente upregulated no EE e LE fases (Figura 7b). A regulação dos genes actP e acs também foi detectada na fase de crescimento exponencial da estirpe parental PB12, que é capaz de co-utilizar Glc e acetato no meio mínimo . Estes resultados estão correlacionados com os baixos níveis de acetato na condição de crescimento assayed (figura 4a). Importante, os valores transcritionais destes genes envolvidos na assimilação de acetato eram baixos na fase ST (figura 7b). Se esta resposta for representativa das outras condições de crescimento utilizadas, poderá explicar parcialmente a acumulação de acetato observada nas fermentações com 100 g/L de Glc, que consomem quantidades mais elevadas de Glc durante a fase estacionária (figura 4b e figura 4c). Estes resultados destacam a actP e a acs como potenciais alvos de genes para aumentar artificialmente a sua expressão em estágios de cultura tardia, aproveitando as capacidades esperadas da estirpe AR36 para utilizar simultaneamente Glc e acetato, presentes na sua estirpe parental PB12 .

os genes presentes no operão sintético mostraram níveis de expressão muito fortes (mesmo em fase estacionária), reflectindo a natureza constitutiva do promotor e o elevado número de cópias do plasmídeo (figura 7c). Estes resultados correlacionam-se com o consumo ininterrupto de Glc e com a produção SA observada durante toda a fermentação (figura 4a), sugerindo que as enzimas codificadas pelos genes no operando estão presentes ao longo do tempo de cultivo. Pode-se ver na figura 7c que os níveis de transcrição de aroD e zwf são comparativamente mais altos e mais baixos, respectivamente, do que os outros quatro genes do operão. Esta observação deve ser feita com precaução, uma vez que os seis genes do operão estão a ser comparados com os presentes no cromossoma da estirpe de referência AR3e. Uma vez que os valores obtidos para os seis genes não são normalizados entre eles, as variações entre a sua expressão cromossómica na estirpe AR3e podem alterar as comparações relativas com a estirpe AR36. No entanto, os dados transcriptômicos são consistentes com a alta relação de SA com intermediários aromáticos obtidos nas condições testadas, o que é esperado se todos os genes do operando foram adequadamente expressos. Juntamente com cinética e estequiométrica de dados, estes resultados realçam os benefícios de empregar um constitutivamente expressa sintético operon como uma estratégia alternativa para aumentar o rendimento de SA da Glc em um evoluiu tensão que carece de PTS e pykF.

expressão Constitutiva de genes selecionados a partir da pentose fosfato e aromáticos vias aumenta o ácido chiquímico rendimento em alta de glicose no lote de culturas de Escherichia coli cepa falta de PTS e pykF

Construção de linhagens derivadas de PB12 aroK-aroL- contendo um plasmídeo projetado para a expressão constitutiva de um sintético operon usado na produção de o ácido chiquímico

Avaliação dos efeitos causados pela pykF inativação em estirpes de expressar o Aro6 operon

perfis de fermentação de AR36 em culturas de lotes

Insights sobre o glycolytic e acetato de metabolismos de tensão AR36 por RT-de acordo com pcr

Published by admin

Deixe uma resposta Cancelar resposta