Fronteiras em Endocrinologia

Introdução

síndrome do ovário Policístico (SOP), a principal causa da anovulação, infertilidade entre as mulheres em idade reprodutiva, é a mais comum desordem do sistema endócrino, afetando 5 a 10% das mulheres em todo o mundo (1). A lipólise acelerada e a dislipidemia Subsequente em mulheres com SOP estão associadas a alterações metabólicas, incluindo obesidade, resistência à insulina e diabetes tipo 2 (T2DM) (2). As alterações reflectidas no fluido folicular (FF) do folículo dominante (3, 4) podem afectar directamente a qualidade e o metabolismo do oócito. Inflamação crônica de baixo grau é comumente atribuída como um mecanismo etiopatogenético de infertilidade. As citoquinas inflamatórias são significativamente mais elevadas entre as mulheres com infertilidade inexplicável (5). Os fatores pró-inflamatórios têm sido mostrados como significativamente associados a maiores taxas de insucesso da fertilização in vitro (FIV), especialmente na fase de implantação, entre mulheres com infertilidade inexplicável (6). Estudos têm encontrado elevados de interferon-gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2) e diminuição do fator de crescimento de transformação beta (TGF-β) níveis, um importante endógenos, anti-inflamatórios mediador, (7) no plasma de mulheres com infertilidade inexplicada em comparação com férteis controles durante a implantação janela (fase lútea) (8). Além disso, doentes inférteis inexplicados demonstraram níveis séricos elevados de IL-2, IL-4, IL-6, IL-21, factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) e IFN-γ, comparativamente com mulheres férteis (5).

os efeitos benéficos dos suplementos de crómio já foram notificados sobre as alterações metabólicas entre as mulheres que sofrem de SOP. In a meta-analysis conducted by Fazelian et al. (9) a suplementação com crómio diminuiu a insulina sérica e a testosterona livre e melhorou o peso corporal em doentes com SOP. Já publicamos as vantagens de tomar suplementos de crómio por 8 semanas no controle glicêmico, parâmetros de risco cardiometabólico e estresse oxidativo em mulheres inférteis com SOP que foram candidatas a FIV (10). Além disso, a suplementação com crómio em ratos diabéticos mostrou actividades anti-diabéticas, que podem ser explicadas através do impacto do crómio na modulação das proteínas do receptor gama activadas pelo proliferador de peroxissomas (PPAR-γ), do substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1) e do factor nuclear kB (NF-kB) (11). Similarmente, Wang et al. (12) verificou-se que, em comparação com ratos de controlo obesos, os suplementados com crómio apresentaram uma melhoria significativa nas suas taxas de eliminação da glucose e um aumento da actividade cinase p-IRS-1 estimulada pela insulina e da fosfatidilinositol-3 nos músculos esqueléticos. Numa outra experiência em animais, a ingestão de crómio durante 7 semanas, por ratos diabéticos, diminuiu significativamente os marcadores inflamatórios incluindo proteína C-reactiva (PCR), TNF-α e IL-6 (13).Tendo em conta os efeitos anti-diabéticos e hipolipemiantes do crómio (11, 14), hipotetizamos que a suplementação de crómio pode ser benéfica em mulheres com SOP e candidatas a FIV, que sofre de diferentes anomalias metabólicas. De acordo com os nossos melhores conhecimentos, nada foi publicado sobre os efeitos da suplementação de crómio na expressão genética da insulina, lípidos e marcadores inflamatórios em mulheres inférteis com SOP que eram candidatas a FIV. Este ensaio destinava-se a determinar os efeitos da suplementação de crómio na expressão genética da insulina, lípidos e marcadores inflamatórios em mulheres inférteis que sofriam de SOP e eram candidatas a FIV.

materiais e métodos

concepção dos ensaios e características dos participantes

este ensaio aleatorizado, em dupla ocultação, controlado com placebo foi registado no Sítio Web iraniano para registo dos ensaios clínicos (http://www.irct.ir:IRCT20170513033941N32). Quarenta mulheres inférteis com SOP, com idades entre 18-40 anos, que eram candidatas a FIV sem história prévia de FIV, foram incluídas. Este estudo foi realizado no Hospital Taleghani, Teerã, Irã, entre fevereiro e maio de 2018. Os critérios de Rotterdam foram utilizados para confirmar o diagnóstico dos PCOS (15). Foram excluídos do estudo os participantes com alterações metabólicas, incluindo disfunção da tiróide, diabetes ou tolerância diminuída à glucose. Esta investigação foi realizada de acordo com a Declaração de Helsínquia e com as directrizes de Boas Práticas Clínicas, e foi aprovada pelo Comité de Ética da investigação da Universidade Shahid Beheshti de Ciências Médicas (SUMS), Teerão, Irão. O consentimento informado por escrito foi assinado por todas as pessoas.

Intervenção

os Participantes foram alocados aleatoriamente em grupos de intervenção para tomar a 200 µg/dia de picolinato de cromo (Natureza, Califórnia, EUA) (n = 20) ou placebo (Barij Essência, Kashan, do irã) (n = 20) de 8 semanas. Suplementos de crómio e placebos foram combinados em termos de forma, aparência, cheiro e embalagem. Randomization was done using computer-generated random numbers. O processo de aleatorização e alocação foi escondido tanto dos pesquisadores quanto dos participantes até a conclusão das análises finais. Outra pessoa, não envolvida no ensaio e sem conhecimento de sequências aleatórias, atribuiu os indivíduos aos frascos numerados de comprimidos. A adesão aos suplementos e placebos, durante todo o julgamento, foi monitorada pedindo aos indivíduos para trazer os recipientes de medicação de volta. Para aumentar a taxa de Conformidade, todos os participantes estavam recebendo pequenas mensagens diárias de lembrete em seus celulares para tomar os suplementos. Os participantes do estudo completaram os registros dietéticos na semana 0, 4 e 8 da intervenção.

a avaliação dos resultados

os níveis séricos de proteína C reactiva de alta sensibilidade (hs-CRP) foram considerados como o resultado primário e os perfis metabólicos foram medidos como os resultados secundários. Amostras de sangue em jejum (15 mL) foram colhidas no início e no final da intervenção de 8 semanas no Hospital Taleghani (Teerão, Irão). Os níveis Hs-CRP foram medidos utilizando o Kit Elisa comercial (LDN, Nordhorn, Alemanha) com variações do coeficiente inter e intra – doseamento (CVs) inferiores a 7%. Os níveis plasmáticos de óxido nítrico (NO) foram medidos utilizando o método Griess (16) com CVs intra-ensaio de < 5%.

isolamento das células linfocitárias

foram utilizadas amostras de sangue para extrair células linfocitárias, utilizando 50% de percoll (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido). A contagem de células e o teste de viabilidade foram realizados utilizando trypan blue, RNA e extracção de ADN (17).

a extracção de ARN e a PCR em tempo Real (RT-PCR)

o ARN foi extraído de amostras de sangue utilizando RNX-plus kit (Cinnacolon, Teerão, Irão). A suspensão de ARN foi congelada a -20°C até a cDNA ser derivada. Após a extracção do RNAs total de cada amostra, o ARN foi quantificado utilizando espectrofotómetro UV. Cada amostra de uma razão de 260/280 de 1.7-2.1 não representou qualquer contaminação com proteínas ou ADN (17). Usando o vírus da leucemia murina Moloney transcriptase reversa (RT), o RNA isolado foi transcrito para a biblioteca cDNA. Expressões Gene do PPAR-γ, glucose transporter 1 (GLUT-1), lipoproteína de baixa densidade de receptores (LDLR), IL-1, IL-8, TNF-α, TGF-β, e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foram realizados em células mononucleares (PBMCs) de sangue periférico, utilizando SYBR green detecção e o produto de amplificação e Kit de aplicação de RT-PCR quantitativo e Luz Cycler tecnologia (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça) (Tabela 1). Os iniciadores gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foram usados como um gene de limpeza. Os iniciadores foram projetados usando software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e software Beacon designer (Takaposizt, Teerã, Irã). Os níveis de transcrição relativos foram calculados utilizando métodos Pffafi ou 2-ΔΔCT.

tamanho da amostra e métodos estatísticos

Tamanho da amostra foi calculado usando a fórmula estabelecida para RCTs, com erros de tipo 1 (α) e tipo 2 (β) foram considerados como 0,05 e 0.20 para fornecer a potência de 80%. Com base num estudo publicado anteriormente (18), foi utilizada uma diferença média (d) de 1500, 0 ng/mL e um desvio-padrão (DP) de 1496, 1 ng/mL para o hs-CRP para calcular a dimensão da amostra. Considerando uma provável desistência de 4 indivíduos em cada grupo de intervenção, o tamanho final da amostra foi determinado como sendo 20 (16 + 4) indivíduos por grupo.

a normalidade dos dados foi avaliada utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov. As análises foram realizadas utilizando a abordagem intention-to-treat (ITT). Foi aplicado um teste t de amostras independentes para determinar as diferenças nas medidas antropométricas e na expressão genética da insulina, lípidos e inflamação entre os grupos de intervenção. Os efeitos da suplementação com crómio nos marcadores inflamatórios foram avaliados utilizando o teste de ANOVA de medidas repetidas. As diferenças nas proporções foram avaliadas pelo teste exato de Fisher. O P < 0, 05 foi considerado estatisticamente significativo. Análises estatísticas foram realizadas usando o pacote estatístico para Ciências Sociais versão 18 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).

resultados

três desistências foram relatadas em cada grupo de intervenção, devido a razões pessoais. Assim, no total, 34 participantes completaram o estudo (Figura 1). Utilizando a abordagem ITT, todos os 40 participantes (20 em cada grupo) foram incluídos na análise final de dados. A taxa de Conformidade neste estudo foi elevada, com mais de 90% dos comprimidos consumidos durante a intervenção em ambos os grupos. Não foram notificados efeitos secundários após o consumo de crómio em mulheres com SOP neste estudo.

as medidas antropométricas não foram estatisticamente diferentes entre os grupos de intervenção (Quadro 2). Além disso, após a suplementação com crómio, os resultados da FIV, incluindo a espessura do endométrio, o número de oócitos recuperados, o número de oócitos fertilizados, a taxa de fertilização, a taxa de Gravidez e o número de embriões não foram significativamente diferentes entre os grupos completados e placebo.

a média da ingestão de macro e micronutrientes também não foi significativamente diferente entre dois grupos de intervenção ao longo do tratamento (Dados Não apresentados).

a suplementação com crómio também reduziu a expressão genética da IL-1 (P = 0, 004) em CPSP comparativamente com o placebo (Figura 3). Não houve um efeito significativo da suplementação de crómio na expressão genética de IL-8, TNF-α, TGF-β e VEGF em CPSP de doentes com SOP.

discussão

encontrámos efeitos benéficos da administração de crómio durante 8 semanas em mulheres inférteis com SOP que eram candidatas a FIV. A suplementação ao crómio reduziu a inflamação e melhorou a expressão genética do PPAR-γ, GLUT-1, LDLR e IL-1, embora não tenha afetado a expressão genética do IL-8, TNF-α, TGF-β e VEGF. Tanto quanto sabemos, este é o primeiro ensaio que relata os efeitos da suplementação de crómio na expressão genética relacionada com insulina, lípidos e marcadores inflamatórios em mulheres inférteis diagnosticadas com SOP e candidatas a FIV.

efeitos do crómio na expressão genética da insulina e no metabolismo lipídico

os doentes com SOP são vulneráveis a diferentes alterações metabólicas, tais como aumento da resistência à insulina, dislipidemia e inflamação crónica (19, 20). O estudo actual revelou que a suplementação de crómio durante 8 semanas para mulheres inférteis com SOP que eram candidatas a FIV aumentou significativamente a expressão genética do PPAR-γ, GLUT-1 e LDLR. Consistente com as nossas descobertas, a administração de crómio a ratos diabéticos mostrou actividades anti-diabéticas, provavelmente relacionadas com o impacto do crómio na modulação das proteínas PPAR-γ e IRS-1 (11). Wang et al. (12) verificou-se igualmente que os ratos obesos completados com crómio aumentaram significativamente as suas taxas de eliminação da glucose. Além disso, em comparação com os controlos obesos, estes ratos mostraram um aumento da actividade cinase p-IRS-1 estimulada pela insulina e da fosfatidilinositol-3 nos músculos esqueléticos. Num outro estudo, o crómio, a biotina ou a sua combinação aumentaram significativamente a expressão PPAR-γ no tecido adiposo, o que pode ter um impacto eficaz na sensibilização à insulina e reduzir a resistência à insulina num modelo de rato diabético (11). O crómio também pode promover o tráfico de GLUT-4 e o transporte de glucose estimulado com insulina (21). Da mesma forma, ratos com retinopatia diabética que foram suplementados com crómio durante 12 semanas mostraram melhoria na expressão genética de GLUT-1, GLUT-3 e insulina (22). O PPAR-γ é o regulador central da insulina, glicose e metabolismo lipídico que é amplamente expresso no tecido adiposo. O PPAR-γ pode melhorar a sensibilidade à insulina e os perfis lipídicos em doentes com diabetes tipo 2, bem como em modelos de roedores diabéticos (23). Evidências atuais sugerem que os agonistas do PPAR-γ podem ser benéficos na diminuição dos lípidos corticais renais e proteinúria através de um mecanismo independente de seu impacto hipoglicêmico (24, 25).

efeitos do crómio na expressão genética dos marcadores inflamatórios

o nosso estudo sustentou que a administração de crómio durante 8 semanas diminuiu significativamente a expressão genética da IL-1 e os níveis séricos da hs-CRP em mulheres inférteis com SOPOS que eram candidatas a FIV, embora não afectasse a expressão genética da IL-8, TNF-α, TGF-β e VEGF. As provas actuais que demonstram os efeitos da suplementação do crómio na expressão genética dos marcadores inflamatórios e dos seus níveis circulantes são escassas e limitam-se principalmente a estudos em animais. A suplementação de crómio durante 8 semanas com ratos gordos diabéticos Zucker (ZDF) diminuiu significativamente os seus níveis séricos de CRP (26). Num outro estudo, a ingestão de niacinato de crómio durante 7 semanas reduziu os níveis de citoquinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e CRP), stress oxidativo e concentrações lipídicas em ratos diabéticos (13). Além disso, a administração de um suplemento nutricional contendo picolinato de crómio, fosfatidilserina, ácido docosa-hexaenóico e boro durante 12 semanas diminuiu significativamente as concentrações de CRP e TNF-α em ratos alimentados com dieta rica em gorduras (27). Não encontramos nenhum efeito significativo da suplementação de crómio em IL-8, TNF-α, TGF-β e VEGF, o que pode ser explicado através da aplicação de diferentes projetos de estudo, tipo e dosagens de crómio utilizado, duração da intervenção e características dos participantes. Doses mais elevadas de crómio podem melhorar significativamente os perfis metabólicos, incluindo IL-8, TNF-α, TGF-β e VEGF. Os marcadores de inflamação e stress oxidativo estão elevados em muitos doentes diabéticos, o que representa positivamente a inflamação vascular (28). A resistência à insulina e a subsequente inflamação vascular são os principais factores de risco para o desenvolvimento de DCV (29). O efeito de supressão do crómio nos marcadores pró-inflamatórios pode ser facilitado pela inactivação das vias de stress oxidativo e pela redução da fosforilação da Akt associada à cascata de resistência à insulina no fígado (30). A evidência actual demonstrou que o aumento das citoquinas inflamatórias está envolvido nos resultados da FIV. Num estudo realizado por Haimovici et al. (31) as mulheres que deram à luz ao vivo o seu feto tinham níveis IL-6 inferiores. A inibição das células lúteas que produzem progesterona na presença de IL-1β pode ser um dos factores que conduzem à falência da implantação (32). O aumento do TNF-α e IL-6 folicular pode deteriorar o microambiente no folículo, afectando assim negativamente a qualidade do oócito e do embrião (33). Num outro estudo realizado por Levin et al. (34), níveis de PCR mais elevados, durante a estimulação da FIV, foram significativamente associados ao insucesso da concepção. De acordo com a evidência acima mencionada publicada, assumimos que os resultados da FIV podem ser influenciados pela redução da inflamação. Um estudo recente demonstrou que a utilização de inibidores TNF-α e imunoglobulina intravenosa melhorou significativamente os resultados da FIV, incluindo; implantação, gravidez clínica e taxas de natalidade vivas em mulheres jovens inférteis com níveis elevados de citocinas auxiliares 1/T (35).Houve algumas limitações neste estudo. Devido a um financiamento inadequado, não conseguimos medir os níveis de crómio e não pudemos avaliar os efeitos do crómio na expressão genética do stress oxidativo.

no geral, nosso estudo sugere as vantagens da suplementação de crómio na redução dos marcadores inflamatórios através da melhoria da expressão genética de PPAR-γ, GLUT-1, LDLR, e IL-1in mulheres inférteis com SOP que eram candidatas a FIV.

Autor Contributions

ZA helped in conception, design and statistical analysis of the manuscript. MA, SZ, NM, EA e SS contribuíram na coleta de dados e Redação de manuscritos. ZA supervisionou o estudo.

financiamento

este estudo foi apoiado por uma subvenção do Vice-Chanceler para a investigação, da Universidade Shahid Beheshti de Ciências Médicas, e de Teerão, Irão.

Declaração de conflito de interesses

os autores declaram que a investigação foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.