Genome-wide análise de condensin obrigatório em Caenorhabditis elegans

Condensins I e II compartilhar as duas SMC subunidades MIX-1 e SMC-4, e distinguem-se por três administradores não-SMC subunidades (Figura 1A). Condensin IDC difere de condensin I por apenas uma subunidade, A variante SMC-4 DPY-27. Nós usamos um ou dois anticorpos diferentes contra cada subunidade de condensina Para ChIP-seq e identificamos esses locais de ligação comuns em múltiplos anticorpos e replicados biológicos (arquivo adicional 1: Tabela S1). A validação de anticorpos e as interacções de co-imunoprecipitação previstas a partir da condensina holocomplex são apresentadas no ficheiro adicional 2. Correlação emparelhada das pontuações médias de enriquecimento com ChIP agrupadas separadamente nas subunidades I-IDC e II, confirmando a distribuição de subunidades individuais entre os três tipos de condensina (figura 1B).

os padrões de ligação de alta resolução dos três complexos de condensina são semelhantes

C. elegans condensin I e II, parcialmente sobrepostos, mas diferentes localizações cromossômicas em mitose e meiose , e condensin IDC é especificamente voltado para o X . Portanto, esperávamos encontrar diferentes padrões de chips-seq para condensin I, IDC e II. em vez disso, os padrões de ligação das subunidades condensin i, IDC e II eram geralmente semelhantes (figura 1C). Esta semelhança não foi devida a reactividade cruzada de anticorpos, porque o anticorpo HCP-6, que não mostra qualquer reactividade cruzada e não imunoprecipita qualquer subunidade de condensina I-IDC , mostrou uma extensa co-localização com subunidades de condensina I-IDC (ver HCP-6 Na Figura 1C). Além disso, se a sobreposição de condensin II fosse devida à reactividade cruzada com condensin IDC, teríamos esperado um enriquecimento dos locais de ligação condensin II no X, O que não era o caso (figura 1D). Em comparação com condensin II, as subunidades de IDC de condensin consistentemente tinham pontuações de chips superiores no X, sugerindo uma diferença na Associação cromossômica dos dois complexos de condensina capturados por ChIP (note diferentes escalas em X e cromossomo I na figura 1C). Desde que realizamos ChIP-seq em embriões de estágio misto, a maioria das células (mais de 95% estimado em 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) coloração) estavam em interfase. A falta de subunidades de condensin I em autossomas (figura 1C e Ficheiro adicional 3: Figura S1A) e a observação anterior de que condensina I localiza-se a cromossomas mitóticos após a quebra do envelope nuclear sugerem que a maioria do sinal ChIP-seq é de interfase. Em apoio a isso, condensina II mostrou ser nuclear durante a interfase, e mostrou uma distribuição mais igual de locais de ligação entre todos os cromossomos (figura 1D).

KLE-2, HCP-6 e CAPG-2 são condensina II específica, representando assim a ligação condensina II. Condensin I e IDC compartilham todas as três subunidades não-SMC, então daqui em diante nos referimos ao sinal ChIP-seq de DPY-26, DPY-28 e CAPG-1 a partir da condensin I-IDC. Para nos concentrarmos nos locais que estão ligados como um complexo, calculamos a média do sinal do ChIP a partir das subunidades de CAP específicas do tipo condensin. Além de usar dados médios, verificamos que cada análise era verdadeira com subunidades únicas, e apresentamos HCP-6 e DPY-28 em números suplementares. Identificámos um conjunto de locais de ligação I-IDC e II de elevada confiança, seleccionando apenas os picos ChIP-seq que eram consistentes em duas ou mais subunidades não SMC (figura 1D). Tal como referido anteriormente, 97% da ligação da condensina I-IDC ocorreu no cromossoma X . Condensin II foi igualmente distribuído entre os autossomas e o X. Condensin II ligado a locais mais fortes de condensin I-IDC no cromossoma X (figura 1E e Ficheiro adicional 3: Figura S1B).

Condensin sítios de ligação são enriquecidos em ativos promotores

Para identificar as regiões onde condensins preferencialmente bind, analisamos condensin sítios de ligação com respeito a várias anotações genômicas. Os locais de ligação da condensina foram significativamente enriquecidos em promotores, perto de genes tRNA e RNAs não codificantes (figura 2A, ficheiro adicional 4: Figura S2). Para eliminar a possibilidade de que condensin ligados a genes tRNA só ocorre promotores, removido tRNA genes que estavam dentro de 1 kb de um local de início da transcrição (TSS) e determinou que a sobreposição de tRNA e condensin sítios de ligação permaneceu significativa (23% e 6% dos tRNAs sobreposta com condensin I-IDC e II, respectivamente, P = 0.0002). Condensina ligando-se aos genes tRNA sugere que o recrutamento de condensina mediada por TFÍLICAS pode ser conservado entre C. elegans e levedura .

Condensin sites são enriquecidas na promotores e tRNAs, e a ligação relaciona-se positivamente com a transcrição. A) são indicados o enriquecimento ou o esgotamento das condensinas em locais de ligação em várias anotações genómicas. O enriquecimento Aleatório e os valores de p foram calculados através de um teste de permutação que distribuiu aleatoriamente os picos de condensina 10 000 vezes. Para ambos os condensina I-IDC e II, existe um enriquecimento significativo de locais de ligação a promotores de 1 kb e perto de RNAs não codificantes (P = 0.0002), depleção dentro dos corpos genéticos (local de início da transcrição (TSS) até ao local de fim da transcrição (TES)) (P = 0, 0002), e sem enriquecimento significativo ou depleção nos 3′ de genes (P > 0, 05). (B) O sinal do ChIP Condensin está alinhado com os TSS dos genes expressos (25% superior pelo nível de ARN, linhas sólidas) e não dos genes expressos (25% inferior pelo nível de ARN, linhas tracejadas). Os pontos circundantes representam o nível de confiança de 95%. Como um controle, o sinal de ChIP de imunoglobulina G (IgG) no TSSs é plotado em cinza. C) O coeficiente de correlação da classificação Spearman entre a pontuação mediana do ChIP a 500 promotores bp e o nível de ARN aos respectivos genes é dado para todo o genoma e para o cromossoma X. Existe uma ligeira correlação positiva entre a ligação e a transcrição de condensina. D) A pontuação mediana do ChIP no intervalo de 500 bp a montante da TSS é calculada em função do nível de ARN de cada gene. Os genes ligados ao promotor da condensina (definidos por sobreposição com um local de condensina dentro de 1 kb do TSS) são realçados em laranja (condensina I-IDC) e azul (condensina II). E)o conteúdo de GC de 50 janelas bp é plotado através de cimeiras de ligação condensin i-IDC e II. Como um controle, o conteúdo de GC mais de 1500 coordenadas aleatórias foi determinado e plotado da mesma forma que os cumes reais de condensin. O conteúdo médio de GC é alto em torno do Pico de ligação de condensin.

a ligação foi mais elevada dentro de 500 bp do TSS (ficheiro adicional 5: Figura S3A) e 45% da condensin i-IDC e 62% dos picos da condensin II estavam localizados em promotores. A ligação da condensina aos promotores correlacionou-se positivamente com a actividade transcritional do gene a jusante (figura 2B,C), mas nem todos os promotores activos estavam ligados (figura 2D). A análise do termo ontológico de genes de promotores ligados mostrou um ligeiro (1, 3 vezes) mas significativo (P = 3, 5 e-17) enriquecimento para genes com função de desenvolvimento embrionário (ficheiro adicional 6: Tabela S2). Aproximadamente 20% dos genes altamente expressos (top quartil pelo nível de RNA) tinham um local de ligação de condensina II dentro de 1 kb, e cerca de 70% dos genes do cromossoma X tinham um local de ligação de condensina I-IDC dentro de 1 kb. Por conseguinte, embora a actividade transcritiva seja importante, não é suficiente explicar a especificidade das condenas que vinculam certos promotores.

notámos que todos os locais de ligação de condensin mostraram um enriquecimento proeminente do conteúdo de GC em comparação com as regiões circundantes e as coordenadas aleatórias (figura 2E). Em C. elegans, o conteúdo de GC dos promotores do cromossoma X é superior ao dos promotores autossómicos . É possível que maior conteúdo de GC seja uma característica de sequência de DNA para a ligação de condensin, e promotores X evoluíram para conter maior conteúdo de GC para suportar a ligação de condensin IDC.

Condensin sítios de ligação coincide significativamente com um subconjunto de fatores de transcrição

Para determinar fatores adicionais que distinguem condensin-vinculado promotores, comparado condensin e TF sítios de ligação, e encontrou um subconjunto do TFs que vinculados a mesma promotores como condensins (Figura 3A). Estudos anteriores mostraram que múltiplos TFs se ligam a um conjunto de locais de ligação de ocupação elevada (HOT) . Verificou-se uma sobreposição de 5% e 22% dos sítios condensin I-IDC e condensin II com sítios quentes, respectivamente (P = 0, 0002). O significado da sobreposição com a TFs manteve-se o mesmo quando os locais quentes foram eliminados da análise (ficheiro adicional 5: Figura S3B). Percentagens de sobreposição para cada TF depende do número de sítios de ligação, e são mostrados no arquivo Adicionais 5: Figura S3C. Entre individuais TFs, descobrimos que 69% dos condensin II e 53% do LIN-13 sites sobrepostos uns com os outros, tornando LIN-13 topo TF significativamente sobreposta com condensin II.

Condensin II vinculação sobrepõe-se com factores de transcrição não aleatoriamente, e a análise da expressão sugere uma função repressiva para condensin II. (A) fator de Transcrição sites de modENCODE são classificados pela dobra de enriquecimento de sobreposição com condensin sítios de ligação. O enriquecimento dobrado é determinado como a relação entre a percentagem de sobreposição observada e a média das distribuições aleatórias de locais de condensa 10 000 vezes ao longo do genoma. Os resultados indicam que a ligação de condensin não é aleatória no que diz respeito aos sites de ligação de TF. B) os diagramas de Venn mostram a sobreposição de locais de ligação de condensina II com LIN-13 (modENCODE_3342, embriões) e LIN-35 (modENCODE_3925, embriões tardios) (top), com LIN-13 apenas (inferior esquerdo) e LIN-35 apenas (inferior direito). A proporção de sobreposição entre condensina II e LIN-13 e LIN-35 é maior nos locais ocupados por ambas as proteínas. A sobreposição indicada representa o número de picos de condensina II que se sobrepõem aos respectivos locais LIN-13 e LIN-35. C) o enriquecimento médio de chips-seq da condensin II, LIN-13 e LIN-35 é plotado ao longo do cume de cada pico da condensin II. Os sítios de ligação Condensin II estão divididos em quatro grupos. O top group consiste de condensin II ligando sites sobrepostos com LIN-13 e LIN-35, a segunda sobrepõe-se apenas com LIN-13, a terceira com LIN-35 apenas e o último grupo não se sobrepõe com LIN-13 ou LIN-35. Os picos estão a diminuir com base no enriquecimento do ChIP. Um grande número de sites condensin II mostram alta LIN-13, mas não LIN-35, ligando. A ligação da condensina II é mais forte nos locais vinculados por LIN-13 e LIN-35. (D) Differential expression analysis (RNA-seq) in kle-2 null heterozygote versus homozygote larval stage 2/3 (L2/L3) larvae. As proporções de genes ligados ou não ligados por KLE-2 com aumento ou diminuição do nível de transcrição em mutantes homozigóticos são mostradas. Níveis de transcrição de proporcionalmente mais genes aumentam em KLE-2 mutante. TF, factor de transcrição.

Lin-13 tem um motivo de interação com proteína retinoblastoma (pRb) e funciona no desenvolvimento vulval com o único PRB homolog LIN-35 em C. elegans . Em D. melanogaster, a subunidade de condensina II dCAPD3 que se liga à cromatina é reduzida com a mutação pRb . Se, em C. elegans, o LIN-13 recruta condensin II através do LIN-35, Então os sítios LIN-13 que também estão vinculados pelo LIN-35 (576) devem sobrepor-se à condensin II mais do que os sítios LIN-13 que não estão vinculados pelo LIN-35 (1,033). A sobreposição dos locais co-ocupados com a Lin-13 e a LIN-35 com os sítios condensin II foi apenas ligeiramente superior à dos sítios LIN-13 sem a LIN-35, 60% e 50%, respectivamente (figura 3B). Inversamente, a sobreposição da LIN-35 com a condensina II foi mais elevada nos sítios que também estavam vinculados pela LIN-13 (45%) em comparação com os sítios não vinculados (9%). Isto sugere que a interação potencial entre a LIN-13 e a condensina II é principalmente independente da LIN-35. LIN-35 funciona dentro de um complexo multi-proteico conservado chamado DRM in C. elegans (hDREAM in humans) que também contém EFL-1 e DPL-1 . Os 555 locais de ligação de MDR que estavam vinculados pela LIN-13 mostraram uma maior sobreposição com a condensina II (63%) em comparação com 787 locais de MDR que não estavam vinculados pela LIN-13 (13%). Dividimos os sites condensin II em quatro grupos de acordo com a sobreposição do site de ligação com LIN-13 e LIN-35 (figura 3C). Este agrupamento indicou que um grande número de condensin II mostra de alta LIN-13 de ligação, mas não LIN-35, sugerindo que, se o problema mediada condensin II recrutamento, está contido em C. elegans, LIN-35 pode depender da presença de LIN-13 para condensin II recrutamento.

a mutação Condensina II causa defeitos transcritivos que sugerem uma função repressiva

na levedura e D. melanogaster, a condensina esteve implicada na repressão transcripcional . Um estudo recente realizado em D. melanogaster indicou que a subunidade da condensina II CAPD3 é necessária para a activação transcritional de um aglomerado de genes peptídicos antimicrobianos . Para entender o papel de condensina II na regulação da transcrição, realizamos RNA-seq em larvas L2/L3 mutantes nulas kle-2. O KLE-2 com carga materna permite que o KLE-2 mutante nulo (Alelo ok1151) cresça e se torne adulto estéril. Comparamos a expressão genética em mutantes KLE-2 heterozigóticos e homozigóticos nas larvas L2/L3 antes da proliferação da germina, contendo assim quase inteiramente núcleos de interfase. A análise da expressão diferencial utilizando o DESeq2 identificou 356 genes cuja expressão foi significativamente diferente na homozigota em comparação com as larvas heterozigotas (taxa de falsa descoberta < 5%; os resultados do DESeq2 são apresentados no ficheiro adicional 7: tabela S3). A maioria dos genes de expressão diferente aumentou (70%) em vez de diminuir (30%) na expressão. A análise do termo ontológico do Gene não revelou um grupo particular de genes que foram afetados pela mutação KLE-2. Similar aos dados publicados para o IDC condensin, não houve correlação direta entre a ligação do KLE-2 e alterações na expressão do gene. Importante é que, entre os 46 genes diferenciadamente expressos e ligados ao KLE-2, 83% aumentaram na expressão em comparação com 67% dos 310 genes que não estavam ligados ao KLE-2 (Figura 3D), sugerindo que o efeito direto da ligação ao condensin II é em grande parte repressivo.

Histona modificações associadas abrir cromatina positivamente correlacionados com condensin ligação

Para compreender a cromatina contexto de condensin ligação, analisamos a relação entre condensin sítios de ligação e cromatina características mapeadas pelo modENCODE . Observamos uma correlação positiva geral entre a ligação de condensina e marcas de cromatina ativa. Na levedura, o número de locais de ligação da condensina durante todo o ciclo celular está directamente relacionado com o comprimento dos cromossomas. O número de C. elegans condensin II binding sites was not proportional to chromosome length (Figure 4A), but positively correlated with the length of chromosomes associated with active histone marks (Figure 4B). O cromossoma X foi uma exceção, talvez devido aos mecanismos de compensação de dosagem que alteram sua cromatina . Condensina I-IDC e II ligando-se ao genoma correlacionado positivamente com marcas de cromatina abertas como H3K27ac e negativamente com marcas de heterocromatina como H3K27me3 e H3K9me3 (figura 4C e arquivo adicional 8: Figura S4). Esta correlação estava no nível de domínio (como analisado em janelas de 1 kb), como não vimos uma modificação histônica particular que atingiu o pico em condensin sites em um tipo de análise ‘metagene’ (dados não mostrados). Em estudos de imunofluorescência, as proteínas centromere sobrepuseram-se à ligação da condensina II às células mitóticas . Não observamos uma correlação positiva entre os sinais de ChIP-seq do CENP-a e condensina II em embriões de estágio misto, sugerindo que, em núcleos de interfase (a maioria dos núcleos em células embrionárias de estágio misto), não há sobreposição. Alternativamente, dado que o CENP-a se liga a apenas um pequeno subconjunto do CENP-a regiões positivas no genoma por célula , a sobreposição do CENP-A com condensina II só pode ser aparente em células únicas. Para entender quais fatores de cromatina melhor predizem a ligação de condensin, nós usamos uma abordagem de aprendizagem de máquina. Em C. elegans, H4K20me1 é altamente enriquecido através do cromossomo X pelo DCC, e assim H4K20me1 foi o fator mais discriminativo para a ligação de condensin IDC (figura 4D). Para condensina II, características de cromatina altamente preditivas são H3K27ac e CBP, ambos marcadores de potenciadores ativos, sugerindo que a ligação de condensina é enriquecida em potenciadores ativos . Entre 201 sites de ligação condensin II que estavam a 2 kb de um TSS anotado, 58 sobrepostos com um site de ligação CBP (P = 0.0002).

os factores de cromatina associados à cromatina aberta e aos potenciadores correlacionam-se positivamente com a ligação à condensina. A) o número de picos de condensina II é representado em relação ao comprimento linear de cada cromossoma. B) O número de picos de condensina II é calculado em função do comprimento do cromossoma coberto pelos picos H4K8Ac e H4K16Ac. Uma linha de tendência adaptada aos dados autossómicos indica uma correlação positiva (R2 = 0, 9). (C) Condensin ligação dentro de 1 kb contíguos windows em todo o cromossoma X (esquerda) e autossomos (direita) correlacionar positivamente com o active marcas (por exemplo, H3K27ac, H2A.Z) e negativamente correlacionados com repressivas marcas (por exemplo, H3K27me3, H3K9me3). D) aprendeu-se um classificador conjunto (florestas aleatórias) a prever a ligação de condensina ao genoma. As 20 características top (entre 92 características totais, arquivo adicional 1: Tabela S1) com a maior potência preditiva são plotadas para condensin I-IDC (esquerda) e condensin II (direita) com a característica mais importante no topo. As características são classificadas com base na diminuição média na precisão, que descreve a diferença entre a taxa de erro da classificação real e a taxa de erro após permutar a característica, média sobre todos os classificadores (árvores).

sequência de DNA motivos enriquecido em condensin sítios de ligação de mostrar características específicas

Embora condensin II vinculados ao condensin I-IDC sites no X, condensin I-IDC não ligar para a maioria dos autossômica condensin II sítios de ligação (Figura 1D). Para compreender a especificidade do recrutamento de condensin IDC e II, procurámos por características da sequência de ADN que distinguem a ligação condensin II e condensin IDC. Estudos anteriores demonstraram que o condensin IDC é inicialmente recrutado para cerca de 100 locais, e depois propaga-se para outros locais cromossómicos . Um motivo de sequência de ADN de 10 bp foi enriquecido nos locais de recrutamento de condensin IDC (figura 5A) e a mutação do motivo aboliu condensin recruitment on extrachromosomal arrays , indicando que o motivo de sequência de ADN de condensin IDC desempenha um papel importante no recrutamento de condensin IDC.

encontrámos um motivo de sequência de ADN contendo GCGC que foi enriquecido sob sítios de ligação condensin II (figura 5A). É interessante notar que tanto o condensin II e condensin IDC motivo, incluídas as GCGC core, mas o condensin IDC motivo foi estendido de um lado por AGGG, sugerindo que a X-a especificidade do condensin IDC, o recrutamento é obtido por co-fatores que reconhecer AGGG. Por todo o genoma, 11% do condensin II motivos foram obrigados por condensin II. Assim, semelhante a outros TFs (por exemplo, ), apenas uma parte do potencial de seqüência de DNA motivos foram obrigados por condensin II. Outros fatores, tais como a cromatina acessibilidade e desconhecido co-fatores podem estar envolvidos na ligação especificidade. De fato, se levássemos esses motivos que estavam em uma janela de 2 kb significativamente enriquecidos para uma marca histônica ativa, como o H4K16ac, a porcentagem de motivos que estavam ligados aumentou de 11% para 29%. Além disso, semelhante ao condensin IDC motivo, o que é mais agrupado na vinculado sites , descobrimos que 1 kb do genoma do windows que continha mais do que um condensin II motivo, foram cerca de 2,5 vezes mais propensos a ser vinculados por condensin II, em comparação com aqueles com apenas um motivo. Portanto, a agregação de motivos e o contexto cromatina aberto ajudam a especificar a seleção dos motivos que estão ligados.

Cromossômicas recrutamento de condensin IDCand condensin II envolve comuns e distintos órgãos reguladores. (A) Motif logos of 10 bp DNA sequence motifs enriched at the top condensin sites are shown. B) é apresentada a sobreposição entre os locais de ligação de condensin I-IDC, condensin II e SCC-2. Os números de cada factor indicam o número total de locais de ligação. Números sobrepostos são baseados no número de picos SCC-2. C) Vista do navegador da Universidade da Califórnia em Santa Cruz (UCSC) exemplificando o sinal SCC-2 ChIP-seq, que é na sua maioria restrito a promotores. D) o SCC-2 e o condensin II ligarem-se a um local de recrutamento de IDC bem definido no X (rex-1). (E) No sdc-2 mutante nulo (TY1072), condensin I-IDC (DPY-26), condensin II (HCP-6, KLE-2) e SCC-2 enlace é diminuída em rex-2 (painel esquerdo), mas continua a ser muito similares no autossomos (painel direito). F) gráfico da relação entre o enriquecimento de ChIP em SDC-2 mutante e o tipo selvagem nos picos de ligação do SCC-2. Os locais de ligação são classificados como sendo em autossomas, no X com baixa ligação SDC-2 e alta ligação SDC-2. G) análise qPCR do enriquecimento com ChIP DPY-27 em embriões isolados de adultos alimentados com Vectores (controlo) e PQN-85 RNAi. O enriquecimento por ChIP é expresso em relação ao local de controlo negativo. Barras de erro são os desvios padrão de três a cinco replicados biológicos. ChIP, imunoprecipitação cromática, DCC, complexo de compensação de dosagem.

nem todos os sites de ligação condensin II têm o motivo. Nos sites condensin II sem o motivo, outros fatores podem ser responsáveis pela ligação. Em alternativa, a baixa proporção de condensin II locais (27%) que contêm um motivo pode ser explicada pela potencial propagação de condensin II após o recrutamento. Não se espera que locais de propagação contenham o motivo. Por exemplo, para a condensin IDC, uma percentagem elevada de potenciais locais de recrutamento (56%) contém o motivo, mas não locais de propagação (8%) . É necessária uma análise sistemática da capacidade de recrutamento dos conden-tos identificados nos sítios II, A fim de resolver a eventual dispersão.

SDC-2 é necessário para a ligação de condensin I-IDC, condensin II e coesin loader aos locais de recrutamento de DCC cromossómicos X

nos metazoanos, as proteínas envolvidas no recrutamento de condensin para os cromossomas não são bem compreendidas. Na levedura, a ligação da condensina sobrepõe-se à do complexo de carga de coesin Scc2/4, o que aumenta a associação da condensina com os cromossomas . Para testar se a sobreposição com o Scc2/4 é conservada entre a levedura e o C. elegans, realizamos uma análise ChIP-seq do SCC – 2 (também conhecido como PQN-85) e descobrimos que um notável 95% dos sites SCC-2 se sobrepuseram com condensin I-IDC no X, e 60% com condensin II genoma-wide (figura 5B). A sobreposição manteve-se semelhante quando as regiões quentes foram excluídas (ficheiro adicional 9: figura S5A). Nem todos os sites condensin se sobrepuseram ao SCC-2, sugerindo que, ao contrário da levedura, condensin não depende do SCC-2 para ligação . A ligação SCC-2 foi mais elevada nos promotores e correlacionou-se positivamente com a transcrição (ficheiro adicional 9: figura S5B). Um motivo de sequência de ADN contendo GAGA estava presente em 58% dos sítios de ligação SCC-2 (ficheiro adicional 9: figura S5C). Ao contrário de Drosophila Nipped-B , e similar a S. cerevisiae Scc2, a ligação SCC-2 não era alta dentro das regiões transcritas, mas permaneceu intergênica (figura 5C).

sobreposição quase completa (96%) dos locais de ligação de condensina II com condensina I-IDC no cromossoma X suporta a existência de mecanismos comuns para a ligação cromossómica de diferentes condensinas. Uma vez que a condensin II e a SCC-2 se vinculam à condensin nos locais de recrutamento da IDC no X (figura 5D e Ficheiro adicional 9: Figura S5D), colocámos a hipótese de que a condensin recrutadores de IDC recrutam também a condensin II e a SCC-2. O recrutamento específico da Hermafrodita de condensina CID para o cromossoma X é realizado por SDC-2, SDC-3 e DPY-30 . Realizamos HCP-6 e KLE-2 (condensin II), DPY-26 (condensin i-IDC) e SCC-2 ChIP-seq em embriões mutantes nulos sdc-2. Na ligação SDC-2 mutante, DPY-26, HCP-6, KLE-2 e SCC-2 foram abolidos num local de recrutamento de condensin IDC específico para X (rex-2) (Figura 5E). Não está claro por que a ligação HCP-6 e KLE-2 em rex-2 foi diminuída em vez de se assemelhar a um local de condensin autossômico. A ligação do SCC – 2 aos autossomas e aos cromossomas X independentes do SDC-2 manteve-se semelhante no mutante sdc-2 em comparação com os locais que estavam ligados pelo SDC-2 (Figura 5F). Os nossos resultados sugerem que o SDC-2, o TF Hermafrodita específico que recruta condensin IDC para o cromossoma X, também recruta condensin II e as coesin a subunidade do complexo de carregamento SCC-2 para os mesmos locais (ficheiro adicional 10: figura S6). Estudos genéticos anteriores estabeleceram que uma mutação nula sdc-2 não causa letalidade embrionária nos homens, pelo que a função da condensina II e do SCC-2 recrutados pelo SDC-2 não é essencial para a condensação e segregação gerais dos cromossomas . É possível que a SCC-2 e a condensina II recrutadas pela SDC-2 tenham uma função de regulação genética específica do hermafrodito.

para testar se o SCC – 2 tem um efeito sobre a associação cromossómica de condensina de IDC no local de recrutamento, realizámos uma análise quantitativa da PCR do chip DPY-27 no controlo versus embriões neutralizados SCC-2. Ao alimentar a RNAi, conseguimos reduzir os níveis de SCC-2 em cerca de 80% (ficheiro adicional 9: figura S5E). Após a derrubada do SCC-2, não vimos uma mudança significativa na ligação do DPY-27 ao rex-1 ou ao rex-2 (Figura 5G). Consistentemente, a análise de imunofluorescência de condensina I e II ligada aos cromossomas meióticos não mostrou uma diferença significativa entre o tipo selvagem e os mutantes scc-2 .