Getting CLARITY: Hydrogel process creates transparent brain
CLARITY process: interview with Stanford bioengineer and psiquiatra Karl Deisseroth. Comprimento: 3:58
“estudar sistemas intactos com este tipo de resolução molecular e escopo global – para ser capaz de ver os detalhes finos e o quadro geral ao mesmo tempo — tem sido um grande objetivo não alcançado na biologia, e um objetivo que a clareza começa a abordar”, disse Deisseroth.
“This feat of chemical engineering promises to transform the way we study the brain’s anatomy and how disease changes it”, said Thomas Insel, MD, director of the National Institute of Mental Health. “O estudo aprofundado do nosso órgão tridimensional mais importante deixará de ser restringido por métodos bidimensionais.”
cérebro adulto intacto do rato antes e depois do processo de clareza de dois dias. Na imagem à direita, as belas estruturas cerebrais podem ser vistas vagamente como áreas de desfocação acima das palavras “número”, “inexplorado”, “continente” e “se estende.”
A investigação, neste estudo, foi realizada principalmente no cérebro de um rato, mas os pesquisadores têm usado CLAREZA no peixe-zebra e preservado cérebro humano amostras com resultados semelhantes, estabelecendo um caminho para futuros estudos de amostras humanas e de outros organismos.
“CLAREZA promete revolucionar a nossa compreensão de como o local e o global mudanças na estrutura do cérebro e a atividade de traduzir em comportamento”, disse Paul Frankland, PhD, cientista sênior em neurociências e saúde mental no Hospital for Sick Children Research Institute, em Toronto, que não estava envolvido na pesquisa. A colega de Frankland, cientista sênior Sheena Josselyn, PhD, acrescentou que o processo poderia transformar o cérebro de “uma caixa negra misteriosa” em algo essencialmente transparente.
um lugar inescrutável
o monte de matéria cinzenta e cablagem que é o cérebro é um lugar complexo e inescrutável. Os neurocientistas têm se esforçado para entender completamente o seu circuito em sua busca de compreender como o cérebro funciona, e por que, às vezes, não.
Karl Deisseroth
a CLAREZA é o resultado de um esforço de pesquisa no Deisseroth laboratório para extrair os elementos opacos — em particular, os lipídios — a partir de um cérebro e ainda manter as características importantes totalmente intacta. Os lípidos são moléculas de gordura encontradas em todo o cérebro e corpo. No cérebro, especialmente, eles ajudam a formar membranas celulares e dão ao cérebro grande parte de sua estrutura. Os lípidos representam um duplo desafio para o estudo biológico, no entanto, porque eles fazem o cérebro em grande parte impermeável tanto para produtos químicos e para a luz.
neurocientistas teriam gostado de extrair os lípidos para revelar a estrutura fina do cérebro sem corte ou seccionamento, mas para um grande problema: remover essas moléculas estruturalmente importantes faz com que o tecido restante se desmorone.Investigações anteriores têm focado em automatizar a abordagem de corte/seccionamento, ou no tratamento do cérebro com moléculas orgânicas que facilitam a penetração da luz apenas, mas não sondas macromoleculares. Com clareza, a equipa de Deisseroth adoptou uma abordagem fundamentalmente diferente.
“nós nos baseamos na engenharia química para transformar tecido biológico em um novo estado que é intacto, mas opticamente transparente e permeável a macromoléculas”, disse Chung, o primeiro autor do artigo.
esta nova forma é criada pela substituição dos lípidos cerebrais por um hidrogel. O hidrogel é construído a partir do próprio cérebro em um processo conceitualmente semelhante à petrificação, usando o que é inicialmente uma suspensão aquosa de moléculas pequenas e individuais conhecidas como monômeros de hidrogel. O cérebro intacto e pós-morte é imerso na solução de hidrogel, e os monômeros infusam o tecido. Então, quando “termicamente despoletado”, ou aquecido ligeiramente a cerca de temperatura corporal, os monômeros começam a convergir em longas cadeias moleculares conhecidas como polímeros, formando uma malha em todo o cérebro. Esta malha mantém tudo junto, mas, o que é importante, não se liga aos lípidos.
com o tecido assim enfiado, a equipa é capaz de extrair lipídios vigorosamente e rapidamente através de um processo chamado electroforese. O que resta é um cérebro 3-D, transparente com todas as suas estruturas importantes-neurônios, axônios, dendrites, sinapses, proteínas, ácidos nucleicos e assim por diante – intactos e no lugar.
indo as coisas uma melhor
clareza então vai uma melhor. Ao preservar a plena continuidade das estruturas neuronais, a clareza não só permite rastrear conexões neurais individuais a longas distâncias através do cérebro, mas também fornece uma maneira de reunir informações moleculares ricas descrevendo a função de uma célula que não é possível com outros métodos.
“Nós pensamos que se pudéssemos remover os lipídios de forma não destrutiva, poderíamos ser capazes de obter luz e macromoléculas para penetrar profundamente nos tecidos, permitindo não apenas a 3-D de imagens, mas também em 3-D, a análise molecular do cérebro intacto”, disse Deisseroth, que detém a D. H. Chen Cátedra.Utilizando anticorpos fluorescentes que se sabe procurarem e se ligarem apenas a proteínas específicas, a equipa de Deisseroth mostrou que pode visar estruturas específicas no cérebro de rato modificado ou “clarificado” e tornar essas estruturas e apenas essas estruturas iluminadas sob iluminação. Os pesquisadores podem rastrear circuitos neurais através de todo o cérebro ou explorar profundamente as nuances dos circuitos locais. Eles podem ver as relações entre as células e investigar estruturas subcelulares. Eles podem até mesmo olhar para as relações químicas de complexos proteicos, ácidos nucleicos e neurotransmissores.
uma renderização tridimensional do cérebro clarificado imaginado a partir de baixo (metade ventral). Um vídeo voador do cérebro de roedor está disponível aqui.
“Ser capaz de determinar a estrutura molecular de várias células e seus contatos através de um anticorpo a coloração é um dos principais recursos de CLAREZA, separada da transparência óptica, o que nos permite visualizar as relações entre cérebro componentes fundamentalmente novas formas”, disse Deisseroth, que é um dos 15 peritos sobre a “equipa de sonho” que vai traçar metas para us $100 milhões cérebro iniciativa de investigação anunciou 2 de abril pelo Presidente Obama.
e em mais uma capacidade significativa do ponto de vista da pesquisa, os pesquisadores são agora capazes de destainar o cérebro clarificado, esvaziando os anticorpos fluorescentes e repetindo o processo de coloração de novo usando diferentes anticorpos para explorar diferentes alvos moleculares no mesmo cérebro. Este processo de coloração / descoloração pode ser repetido várias vezes, os autores mostraram, e os diferentes conjuntos de dados alinhados uns com os outros.
Abrir a porta
CLAREZA, por conseguinte, tem feito o possível para realizar altamente detalhadas, belas-análise estrutural em cérebros intactos, mesmo os tecidos humanos, que foram preservados por muitos anos, a equipe mostrou. Transformar cérebros humanos em espécimes transparentes, mas estáveis, com cablagem acessível e detalhes moleculares pode produzir uma melhor compreensão dos fundamentos estruturais da função cerebral e da doença.
visão tridimensional do hipocampo manchado mostrando neurônios fluorescentes expressantes (verde), conectando interneurões (vermelho) e suportando glia (azul).
para além do benefício imediato e aparente para a neurociência, Deisseroth advertiu que a clareza tem deixado a nossa capacidade de lidar com os dados. “Transformar quantidades maciças de dados em insight útil coloca imensos desafios computacionais que terão de ser enfrentados. Teremos que desenvolver abordagens computacionais aprimoradas para segmentação de imagem, registro de imagem 3-D, rastreamento automatizado e aquisição de imagem”, disse ele.De facto, tais pressões aumentarão à medida que a clareza poderá começar a apoiar uma compreensão mais profunda dos sistemas biológicos e órgãos intactos em larga escala, talvez até organismos inteiros.
“De particular interesse para o estudo futuro são intrasystem relações, não apenas no cérebro de mamíferos, mas também em outros tecidos ou doenças, para as quais plena compreensão só é possível quando minuciosa análise única, intacto sistemas pode ser realizado”, Deisseroth, disse. “Clareza pode ser aplicável a qualquer sistema biológico, e será interessante ver como outros ramos da biologia podem colocá-lo em uso.”
outros co-autores incluem a estudante de graduação Jenelle Wallace; pós-graduação studentsSung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin e Logan Grosenick; assistentes de pesquisa Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak e Charu Ramakrishnan; pós-doutorado estudiosos Arão Andalman, PhD, e Tom Davidson, PhD; ex-estudante de graduação Ana Bernstein; e ex-funcionários do cientista Viviana Gradinaru.A pesquisa foi apoiada pelo National Institute of Mental Health (grant MH099647); a National Science Foundation; a Simons Foundation; o Presidente e reitor da Universidade de Stanford; The Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby and Yu foundations; the DARPA REPAIR program; and the Burroughs Wellcome Fund.
o Departamento de Bioengenharia de Stanford também apoiou o trabalho. O departamento é operado conjuntamente pela Escola de engenharia e pela Escola de Medicina.
