How to design gRNA for CRISPR genome editing?
o gRNA guia o sistema CRIPR Cas9 para a localização genômica direita para realizar uma quebra de cadeia dupla.A especificidade targerting do sistema CRISPR Cas9 é determinada pelos 20 nucleótidos na extremidade 5′ do gRNA. Os pares de base gRNA para a cadeia complementar da sequência-alvo e nuclease Cas9 realiza uma quebra dupla de cadeia.
durante a concepção de um gRNA seguindo as coisas devem ser tidas em conta.
1) teor de GC: O intervalo típico é entre 40% – 80%. Um maior teor de GC estabiliza o ARN-DNA duplex, desestabilizando hibridizações fora do alvo
2) Comprimento: O comprimento pode ser ajustado e variar de 17-24 pares de base. Uma sequência mais curta leva a efeitos minimizados fora do alvo. (17 bp é o limite mais baixo no comprimento da sequência de guiamento, qualquer comprimento da sequência de guiamento qualquer comprimento menor que 17 tem uma chance estatística de direcionar loci genômico múltiplo.)
3)potenciais efeitos fora do alvo: tolerância ao desfasamento e o local de destino é o que leva a efeitos fora do alvo. Isto pode ser reduzido por pesquisas de efeito alvo em larga escala do genoma.
Existem muitos sites que ajudam na concepção de gRNAs. Alguns deles são Chop Chop (Harvard), designer do Instituto alargado sgRNA, e Biotools.
eu estou explicando como usar o Chop Chop site aqui,
1) ir para https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Selecione Espécies
3) Selecionar espécies específicas de genes de identificação ou cortar e colar os nucleotídeos de interesse, e iniciar a análise.Uma vez feita a análise, será apresentada a representação gráfica da gRNA específica do local. Cada gRNA potencial também mostrará os possíveis efeitos fora do alvo. Selecione os que têm menos efeitos fora do alvo.
