identificação e Detecção por PCR de Clostridium chauvoei em isolados clínicos, fezes de bovinos e substratos a partir de biogás planta
Amostras de casos suspeitos de blackleg
Para o músculo a partir de amostras de casos suspeitos de blackleg, os resultados da cultura em FAA placas seguido por PCR de colônia material estava em acordo com, ou executada, mesmo melhor, que a identificação bioquímica método (Tabela 2). Estes resultados são consistentes com Uzal et al. . Este estudo demonstrou que a preparação do ADN a partir da cultura antes da PCR produziu melhores resultados do que a PCR aplicada directamente na biomassa.
a cultura seguida de métodos de identificação bioquímica é complicada em amostras com um elevado teor de flora contaminante devido à necessidade de cultura pura e a sensibilidade foi substancialmente inferior à cultura e à PCR. Em oito casos, foi impossível detectar C. chauvoei por cultura e identificação bioquímica, mas o organismo foi detectado pela PCR (Tabela 2). Para fazer um diagnóstico de blackleg, tecido muscular é tomado na autópsia uma vez que a quantidade de C. chauvoei provavelmente é maior no tecido muscular do que no sangue. A única amostra de sangue foi tirada incorrectamente, mas a questão era blackleg.
da mesma forma, em um estudo anterior de um surto de blackleg, cultura e detecção por PCR deu melhores resultados do que a análise bioquímica . Em um dos casos, a cultura primária de um músculo em uma placa de ágar de sangue foi overgrown por C. septicum mas deu resultados positivos claros para C. chauvoei no PCR.
na maioria dos casos clínicos de perna negra, a quantidade de C. chauvoei em tecido infectado é alto e pode ser facilmente detectado pelo método PCR independente da contaminação da flora. Além disso, o método PCR é muito mais rápido do que o método tradicional de detecção bioquímica, que leva pelo menos cinco dias, e é importante ter uma cultura pura da estirpe, que pode exigir tempo extra para a cultura. Para evitar a contaminação da flora, o tecido muscular não deve ser muito pequeno; aproximadamente 100-200 g seria adequado. Sem cultura pura, nenhuma cepa pode ser para estudos subsequentes no futuro, o que é uma desvantagem de usar a detecção de PCR como o único método.
em bovinos infectados experimentalmente por C. chauvoei, foram realizadas análises de PCR sobre músculos picados e outros órgãos e C. chauvoei foi detectado em todos os órgãos testados . As partes musculares picadas de casos suspeitos de perna negra foram directamente testadas pela PCR e comparadas com a cultura. A detecção por PCR deu melhores resultados do que a cultura e a identificação bioquímica , o que está em desacordo com os resultados do presente estudo, em que apenas 12% (3 em 24) das partes do sangue ou do músculo estavam acima do limiar de detecção da PCR, enquanto 9% das amostras de sumo de carne estavam acima do limiar de detecção (Quadro 2). As substâncias inibitórias estão provavelmente presentes nos tecidos musculares. Foram identificados inibidores para a reacção enzimática da amplificação da PCR no fígado, baço e rim e podem existir inibidores semelhantes presentes no tecido muscular. Os resultados das partes musculares maceradas em amostras fisiológicas estéreis de solução salina (26%) não correspondiam bem aos do teste bioquímico. A PCR directa sobre o tecido muscular ou outras amostras similares não é provavelmente adequada para substituir as etapas de cultura seguidas por testes bioquímicos ou por PCR.
amostras de músculo colhidas em esfregaços
para investigar se é necessário enviar tecido muscular para análise de C. chauvoei ou se é suficiente utilizar esfregaços para recolha de amostras, foi simulado um serviço postal. Dos 22 tecidos musculares investigados, 64% estavam acima do limiar de detecção da PCR. Para esfregaços das mesmas amostras após simulação do Serviço postal, 36% a 47% de esfregaços foram superiores ao limiar de detecção (Quadro 3). Seria mais prático colher amostras com esfregaços em vez de tecidos musculares se os esfregaços fossem suficientes para a análise de C. chauvoei. No entanto, os tecidos musculares deram mais amostras positivas do que esfregaços quando ambos foram analisados por cultura e PCR (Quadro 3). A incidência de C. chauvoei em esfregaços dos casos positivos do tecido muscular pareceu ser aleatória. No entanto, pareceu fazer pouca ou nenhuma diferença se os esfregaços foram armazenados durante 1, 3 ou 6 dias.
amostras de unidades de biogás
Clostridium chovoei foi detectada em 3 amostras de 11 em substrato de biogás antes da pasteurização, mas não pôde ser detectada após a pasteurização ou após a digestão (Quadro 4). As bactérias presentes nestes tipos de amostras podem provir de estrume ou de subprodutos animais provenientes do matadouro, uma vez que ambas as fontes são utilizadas para a produção de biogás. Nenhuma das explorações amostradas neste estudo envia o seu estrume para as unidades de biogás devido à distância geográfica, mas os animais são enviados para o matadouro local. Também foram notificados casos de perna negra na bacia hidrográfica da unidade de biogás.
após a transformação do biogás, os resíduos digeridos são utilizados como fertilizante. As bactérias formadoras de esporos podem sobreviver à pasteurização e digestão nas plantas de biogás e os resíduos digeridos das plantas de biogás podem, por conseguinte, ser capazes de espalhar blackleg para novas áreas. No entanto, não há C. o chauvoei foi detectado em produtos transformados, pelo que talvez o ambiente do digestor não seja adequado para C. chauvoei, ou para a flora do digester outgrows C. chauvoei. Os esporos clostridianos podem sobreviver por longos períodos no solo, o que deve ser tido em conta em estudos adicionais sobre C. chauvoei em digester.
Amostras de fazendas
apesar do fato de que todas as fazendas investigados relataram casos suspeitos de blackleg nos últimos anos, todas as amostras de fezes, solo e silagem de testes negativos para o C. chauvoei. Pode haver várias explicações para isso. Os esporos ainda podem estar presentes no material, mas abaixo do nível de detecção. Além disso, os inibidores da PCR podem estar presentes nas amostras e a PCR pode ser dificultada . As fezes dos bovinos contêm ácidos gordos voláteis (VFA) e as amostras de solo podem conter vestígios de metal, ambos conhecidos por interferirem com a reacção PCR. No entanto, a fase de cultura antes da PCR reduz a influência das substâncias inibitórias.
Desde C. chauvoei é uma bactéria do solo pode ocorrer alguma variação sazonal, por exemplo, chuvas fortes podem contribuir para a propagação dos esporos e a quantidade de esporos no solo pode ser mais acessível para o gado. A maioria das amostras foi realizada no início do outono, quando o tempo estava ensolarado e, assim, a concentração de esporos nas amostras seria esperado para ser baixa. O número de amostras pode ter sido insuficiente para a detecção de contaminação ambiental. No entanto, por razões práticas, raramente se dispõe de um número muito elevado de amostras ambientais a partir do campo.
os casos suspeitos de perna negra nas explorações ocorreram principalmente em vitelos e novilhas, mas uma exploração comunicou um caso numa vaca adulta. Sete das onze explorações A-K apresentavam rotinas de vacinação no momento da amostragem (Quadro 1).
duas das explorações armazenaram estrume antes de espalhar e as outras Não, mas nenhuma das explorações espalhou estrume nas pastagens. Os veterinários locais teriam visto mais casos de blackleg após a limpeza de arbustos na Ilha de Öland, especialmente em Alvaret (uma planície árida de calcário, com quase 40 km de comprimento e 10 km de largura, com flora especial dependendo do solo fino e pH elevado). Alvaret é geralmente usado como pasto por fazendas vizinhas. No ano da amostragem, não tinha sido feita muita limpeza de arbustos.
PCR
os procedimentos culturais são caros e demorados, e a contaminação com outras bactérias anaeróbias que superam o crescimento de C. chauvoei frequentemente causa problemas . Ao utilizar PCR, o ADN de células viáveis e não viáveis é amplificado. Se apenas forem detectadas células viáveis, pode ser aplicado um passo de enriquecimento . Neste estudo, a cultura em placas FAA antes da PCR foi utilizada para evitar a detecção de bactérias não viáveis e reacções de PCR falsas positivas. O ADN é fácil de amplificar a partir de culturas puras, mas surgem problemas com amostras contaminadas, tais como amostras de resíduos biológicos. A detecção do ADN pela PCR pode ser dificultada por numerosas substâncias, incluindo ácidos húmicos, VFA, gorduras e proteínas . No entanto, a fase de cultura antes da PCR foi utilizada como fase de enriquecimento e, por conseguinte, reduz a influência das substâncias inibitórias. Devido à flora, não foi possível purificar as placas da FAA.
limiar de detecção do método de PCR
o nível de detecção foi de 200 ufc/g. pode parecer um nível de detecção fraco, mas pode ser explicado pelo facto de amostras como estrume, solo e substrato de biogás estarem fortemente contaminadas pela flora circundante. Sasaki relatou um nível de detecção de 10 ufc / g, aparentemente em amostras mais limpas. No entanto, uma vez que o nível de detecção no nosso estudo era de 200 ufc/g e que se esperava que essas amostras contivessem um baixo número de C. chauvoei. Assim, o método utilizado no presente estudo não é praticamente aplicável.
aspectos ambientais
o limiar de detecção do método PCR após a pré – cultura dificilmente é adequado na fase actual para garantir que os animais estão isentos de infecção ou para determinar o estado das pastagens. Em vez disso, as recomendações actualmente aplicadas têm de ser utilizadas, uma vez que o método não pode ser utilizado como base para as rotinas de vacinação. Em áreas onde a perna negra é endémica, recomenda-se a vacinação anual antes do pastoreio, apesar dos custos e do tempo necessário.
este estudo deu algumas indicações de que C. chauvoei não passa pelo processo de biogás. O número de C. chauvoei em biowaste talvez tenha diminuído no digestor para um nível inferior ao limiar de detecção do método, pelo que o risco de propagação de resíduos digeridos é negligenciável. Mais estudos sobre a sobrevivência clostridial através do processo de biogás são necessários antes de conclusões definitivas podem ser tiradas. No entanto, as vantagens dos resíduos digeridos como fertilizante talvez superem o risco de propagação da perna negra.
