Injetável colágeno humano recombinante matrizes limite de remodelamento adverso e melhorar a função cardíaca após o infarto do miocárdio

Estudo

Aqui, realizamos um estudo para (i) design clinicamente relevantes colágeno hidrogéis usando humano recombinante collagens tipo I e tipo III; (ii) caracterizar e comparar as propriedades físicas do rHCI e rHCIII materiais; III) avaliar o potencial terapêutico dos materiais para o tratamento do EM em ratinhos; e IV) identificar os mecanismos subjacentes aos efeitos terapêuticos observados do tratamento com rHC. Para experiências in vivo, a ligação da artéria jovem em ratinhos foi escolhida como um modelo animal clinicamente relevante e bem estabelecido de em. Para avaliações funcionais, histológicas e moleculares, o número de animais por grupo foi minimizado para três a quinze ratos, como especificado nas lendas da figura. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente aos grupos de tratamento e todas as análises foram realizadas de forma cega.

Preparação e caracterização de rHC matrizes

1% de colágeno solução foi preparada pela dissolução de 0,1 g de colágeno liofilizado (rHCI e rHCIII, a partir de Fibrogen) em 10 ml de ultra-pura ddH2O. O sulfato de condroitina (CS; Wako), N-etil-N-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (ECD) e N-hydroxysuccinimide (NHS) foram adicionados para produzir uma mistura final com uma massa proporção de 1:4:0.5:0,3 por colágeno:CS:NHS:ECD. Os materiais foram preparados em gelo utilizando um sistema fechado que permite a mistura homogénea sem adição de bolhas. Após uma mistura completa, o pH foi ajustado para 7.4 por NaOH (1, 0 N). Matrizes sem CS foram preparadas da mesma forma, mas com PBS adicionados para compensar o volume de CS. As matrizes marcadas com Alexa-Fluor®594-NHS foram preparadas adicionando 20 µL da solução-mãe do corante (1 mg/mL em DMSO) ao gel antes de adicionar o NaOH (25 nmol de corante por hidrogel), seguido de 20 etapas de mistura.

viscosidade do Material

medições de viscosidade foram realizadas usando um Brookfield R / S Mais rheometer (Brookfield) a 37 °C. um fuso C25–2/30 cónico foi usado para comprimir o material (deslocamento de 50 µm) em um pedestal controlado a temperatura. A viscosidade foi medida com um bloco rotativo na rampa a uma velocidade de 1/min unidades pré-fixadas a uma velocidade de cisalhamento de cinco unidades ao longo de um tempo de 30 min.

Degree of cross-linking

Differential scanning calorimetry (DSC) experiments were carried out to assess the degree of cross-linking. Brevemente, medições foram realizadas em um calorímetro de varredura diferencial Q2000 (instrumentos TA) na faixa de 8 a 80 °C usando uma taxa de varredura de 5 °C min−1. As matrizes de colagénio (5-20 mg) foram secas à superfície com papel de filtro e hermeticamente seladas com uma tampa de alumínio (Tzero; Instrumentos TA) numa amostra de alumínio (Instrumentos Tzero; TA). A temperatura de desnaturação (Td) foi medida no início do Pico endotérmico.O teor de água das matérias foi medido pesando o peso húmido (W0) da amostra, estabilizado em PBS durante 96 h a 4 °C. O material foi então seco a vácuo à temperatura ambiente durante 96 h para obter a massa seca (W). O teor total de água dos hidrogels (Wt) foi então calculado de acordo com a equação:

a Degradação

degradação Enzimática foi avaliada por meio de 50-100 mg de hidrogel colocada em 5 ml de colagenase tipo I (10 U/ml em PBS) a 37 °C. O restante da massa sólida foi medido ao longo de um período de até 24 h. A taxa de degradação é calculado a partir da inclinação inicial das parcelas do restante massa vs. tempo e comunicado mg/min.

porosidade Material

microscopia eletrônica de varrimento de baixa temperatura (crio-SEM) medições foram realizadas a -50 °C usando um Tescan (modelo: Vega II-XMU) equipado com um suporte de amostra de fase fria, um detector de elétrons de retrospecção (EEB), e um detector de elétrons secundário (SE). Os tamanhos dos poros foram medidos a partir de pelo menos 250 indivíduos de 4 a 6 áreas aleatórias da amostra usando software ImageJ®. O diâmetro dos poros foi quantificado usando o eixo longitudinal do poro usando a ferramenta de linha reta. A área da imagem foi ajustada em função da barra de tamanho obtida do Tescan Vega II system65.

experiências com animais

todos os procedimentos foram aprovados pelo Comité de Cuidados com animais da Universidade de Ottawa, e realizados de acordo com o National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

MI modelo

MI foi induzido em ratos fêmeas com 9 semanas de idade C57BL/6 (Charles River; o número de ratos/grupo está nas lendas da figura) e a administração do tratamento foi realizada utilizando um protocol26 estabelecido,27. Os ratos foram anestesiados (2% isoflurano), intubados, e o coração foi exposto através da quarta toracotomia intercostal. A artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) foi então ligada logo abaixo de sua emergência a partir do átrio esquerdo. Este procedimento resulta em um grande ia envolvendo as partes anterolateral, posterior e apical do coração, que foi confirmado no momento da cirurgia por descoloração do miocárdio na região fornecida pela artéria. A buprenorfina de acção curta foi administrada pelo menos uma hora antes da cirurgia, e a buprenorfina de acção prolongada foi administrada por via subcutânea imediatamente antes da cirurgia para a analgesia perioperativa. Em 1 semana de pós-MI (linha de base), os ratos foram distribuídos aleatoriamente para receber o tratamento de PBS (controle), rHCI, ou rHCIII matrizes, entregue em cinco equivolumetric submetidos a injeções (10 µl de cada site, 50 µl total) através de um 27-G usando uma agulha guiada por ultra-som fechado no peito do procedimento. A seringa é fixada num micromanipulador (Visualsónicos) e, antes do procedimento de injecção, tanto a sonda de varrimento da agulha como a RMV estão alinhadas ao longo do eixo do coração. Através do campo de visão ultrassom, o micromanipulador é usado para posicionar a ponta da agulha estava no local desejado no miocárdio para a administração das injecções (ver Figura suplementar). 1 e Vídeo suplementar 1). Os ratos foram mortos por anestesia terminal aos 2 dias ou 4 semanas após o tratamento e os corações foram recolhidos para histologia e/ou medição das propriedades mecânicas.

Ecocardiografia

ecocardiografia Transthoracica foi realizada em visões de longo eixo usando um sistema Vevo770 em Modo B com uma sonda de micro-análise em tempo real da série 707B (VisualSonics). A imagiologia foi realizada no início do tratamento antes da injecção (7 dias após a em) e 28 dias após a injecção para determinar a fracção de ejecção ventricular esquerda (FEVE), a alteração da área fraccionada (FAC), o volume sistólico final (ESV), o volume diastólico final (EDV), o volume do AVC e a potência cardíaca. Note – se que o LVEF, o ESV e o EDV são utilizados como indicadores clínicos de HF e sobrevivência após o MI44.Imagem Ex vivo da matriz rotinada Alexa-Fluor®594

as matrizes de rHC quimicamente marcadas (25 nmol de corante por hidrogel) foram injectadas no coração do rato, tal como acima descrito. Os animais foram mortos em 2 h, 2 dias, e 7 dias após o tratamento, e os corações foram colhidas e imagens ex vivo por IVIS® Spectrum (PerkinElmer) para visualizar rHCI e rHCIII a distribuição dentro do coração (λexcitation: 570 nm; λemission: 640 nm). Para a histologia, as seções tecidulares foram preparadas em acetona e, em seguida, manchadas com DAPI seguido por imagens usando um scanner de diapositivos Leica Apertio Versa com uma ampliação final de ×20 e uma pilha Z com oito passos a 1,5 µm.

a análise da estirpe

a ecocardiografia Transdorácica foi realizada em vistas de eixo longo utilizando um sistema Vevo3100 em Modo B com uma sonda de micro-avaliação em tempo real da série MX400 (VisualSonics). A imagiologia foi realizada no início do tratamento antes da injecção (7 dias após a em) e 2 dias após a injecção para determinar a estirpe endocárdica longitudinal no momento do fecho da válvula aórtica (representando o sistol terminal). A estirpe no segmento 5 (o segmento médio anterior), correspondente à zona fronteiriça visada para a injecção de tratamento, foi analisada utilizando a aplicação Vevostrain do software Vevo LAB 3.1.1 (VisualSonics)41. Os exemplos representativos das medições efectuadas são incluídos na figura complementar. 10 para todos os grupos experimentais mais um animal saudável (não-canelado).

electrocardiografia

electrocardiogramas foram obtidos simultaneamente com ecocardiografia utilizando um sistema Vevo3100 (VisualSonics) no início do tratamento antes da injecção (7 dias após a em) e 2 dias após a injecção. Foram exportados electrocardiogramas do Laboratório Vevo 3.1.1. software (VisualSonics). O comprimento dos intervalos PR, QT e QRS foi determinado usando o software ImageJ (tabela suplementar 1).

as propriedades mecânicas do miocárdio

ratinhos foram eutanasiados por anestesia terminal 2 ou 28 dias após o tratamento, e os corações foram colhidos. Foram extraídas peças rectangulares (2,5 × 5 mm) do ventrículo esquerdo, compreendendo a cicatriz e a zona fronteiriça. Para determinar a elasticidade do tecido (módulo de elasticidade de Young), as amostras foram submetidas a testes mecânicos em um testador mecânico Universal (Modelo 3342, Instrun) equipado com software de série IX/S, usando uma velocidade de cabeça cruzada de 10 mm min−1.

Histologia / imunohistoquímica

lâminas de secções do tecido do miocárdio foram preparadas a partir de um subconjunto de corações que não foram utilizados para a medição das propriedades mecânicas. Aos 28 dias após a injecção, os corações foram colhidos, perfurados com PBS, incorporados em OCT, e snap-congelados em nitrogênio líquido. Secções de 10 µm foram cortadas usando um criostato. Para avaliar o tamanho da cicatriz, as secções tecidulares foram fixadas em 4% PFA durante 1 h e manchadas com o procedimento tricromo de Masson (Sigma). Imagens tiradas com um microscópio BX50 do Olimpo usando um objetivo de 2×, e oito seções por rato foram usadas para medir a espessura da parede remota e para determinar o tamanho da cicatriz usando o método de arco de linha média usando software66 MIQuant. Para a imunohistoquímica, as secções tecidulares foram fixadas em acetona durante 20 minutos, permeabilizadas com Tritão a 0, 1% durante 10 minutos e depois bloqueadas no soro a 10% durante 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram aplicados durante a noite a 4 ° C no soro a 10%, tendo as lâminas sido enxaguadas e tratadas com anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente, antes de serem montadas com meio de montagem fluorescente (Dako). Para a detecção de vasos sanguíneos e miofibroblastos, PECAM-1 (também conhecido como CD31; Santa Cruz 101454, 1:50) e α-SMA (Abcam 5694, 1:200) anticorpos foram usados e detectados com AF594 anti-rato (tecnologias de vida A11008, 1:500) e anti-coelho AF488 (tecnologias de vida A11007, 1:500), respectivamente. Os macrófagos M2 foram detectados pelo anticorpo anti-CD206 conjugado AF488 (Biolegend 141710, 1:50). Para troponina cardíaca I coloração, as secções foram incubadas com AF488 rotulado de gérmen de trigo agglutinin (ThermoFisher, W11261) por 1 h a 37 °C, seguido de incubação com cabra troponina cardíaca I anticorpo primário (Abcam ab56357, 1:200) e detectado pelo burro anti-cabra AF594 anticorpo secundário (Life Technologies Uma-11058, 1:500). Finalmente, para connexin 43 coloração, as secções foram incubadas com connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) e troponina cardíaca I (Abcam ab188877, 1:200) primária de anticorpos seguido de detecção com AF488 anti-coelho (Life Technologies A11007, 1:500) e burro anti-cabra AF594 anticorpo secundário (Life Technologies Uma-11058, 1:500), respectivamente. As imagens fluorescentes foram obtidas através de um microscópio Zeiss Axio Observer com um objectivo ×20 e, para a conexão, 43 secções manchadas, foi utilizado um scanner de diapositivos Leica Apertio Versa com um objectivo de 20×. Para todas as manchas IHC, quatro seções por rato foram analisadas e para cada seção 2-4 imagens dentro da zona de fronteira, enfart e regiões remotas foram usadas para análise. Para a coloração H &e, as secções tecidulares foram fixadas em 10% de formalina. As seções foram então manchadas primeiro na solução de hematoxilina gill n. o 2 por 7 Minutos, seguido de diferenciação de álcool ácido, e em seguida 0,5% de eosina por 7 Minutos, seguido de desidratação (todas as soluções de Sigma). Imagens foram tiradas com um microscópio Olympus BX50. A zona fronteiriça foi designada como FOV directamente adjacente a ambos os lados da região do enfarte, que começa quando 50% do LV é tecido cicatricial fibrótico (ver Figura suplementar). 11 para uma representação esquemática).

cx3cr1-EGFP mouse experiments

To evaluate the recruitment of circulating mononuclear cells to the myocardium following rHC treatment, B6.129P-Cx3cr1 tm1t/J mice (Cx3cr1-EGFP) were purchased from the Jackson Laboratory. Estes ratos expressam proteína fluorescente verde melhorada em monócitos, células dendríticas, células NK e microglia cerebral, e são um modelo relatado para o estudo do recrutamento de células mononucleares para o heart67. Após uma semana de enfarte do miocárdio, os ratos receberam um tratamento de 50 µl de PBS, rHCI ou rHCIII, conforme descrito acima. Os animais foram mortos 2 dias após o tratamento e o sangue foi colhido em tubos EDTA. Além disso, os corações foram perfundidos com PBS e o ventrículo direito e a região apical do ventrículo esquerdo foram coletados. Os tecidos foram enxaguados com HBSS e digeridos em 2.4U / ml dispase I (Roche) e 1 mg/ml de colagenase B (Roche) durante 40 minutos a 37 °C. As amostras foram lavadas três vezes com PBS, centrifugadas durante 5 minutos a 400 g, e as células isoladas foram preparadas para a citometria de fluxo (FACS Aria III; Becton Dickinson). As células foram marcadas com APC anti-mouse/humanos CD11b (Biolegend 101211), PE anti-mouse Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-mouse F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-mouse CD38 (Biolegend 102717) e Alexa Fluor® 700 anti-mouse CD206 (Biolegend 141733), seguindo o fabricante recomenda as diluições (0.25 µg/L por 1 × 106 células para CD11b, Ly-6G/6C, CD38 e CD206, e 1 µg/L por 1 × 106 células para F4 / 80). Ver Figura Suplementar. 12 para a estratégia de triagem / triagem.

isolamento celular e citometria de fluxo para subconjuntos de monócitos

dois dias após a injecção, os ratinhos foram mortos por inalação de CO2 seguida de luxação cervical. O sangue foi colhido em ratinhos através de punção cardíaca numa solução EDTA de 50 mM, e os glóbulos vermelhos foram lisados com tampão de lise dos glóbulos vermelhos (RBC) de acordo com o protocolo do fabricante (Biolegend 420301). As células foram isoladas a partir de colhidas mouse coração usando uma digestão tampão contendo: DNAse I (50 U/µL; Sigma D5025), colagenase tipo II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), colagenase D (De 0,15 U/mL; Sigma 11088866001), e hialuronidase (10 U/mL; Sigma H3506). Após uma hora de digestão a 37 ° C, As células cardíacas isoladas passaram por um filtro de 70 µm. Finalmente, os baços colhidos do rato foram esmagados e triturados através de um filtro de 70 µm seguido de incubação com tampão de lise dos glóbulos vermelhos (RBC). Os pellets celulares foram recolhidos por centrifugação a ×400g durante 5 minutos a 4 ° C. As células isoladas de todos os tecidos foram incubadas com um corante Aqua fixável Zombie (1:500, Biolegend 423101) durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, os receptores Fc foram bloqueados com o reagente TruStain X (1: 100, Biolegend 103319) durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram, então, incubadas com um anticorpo de cocktail condições para 45 min à temperatura ambiente contendo CD45-APC/Fogo 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17A2), B220-AF488 (1:50, Biolegend RA3-6B2), F480-AF647 (1:100, Biolegend BM8) e Ly6C-BV421 (1: 80, BD Biosciences AL-21). A citometria de fluxo foi realizada usando uma FACS Aria III BD, e os dados foram analisados com software FlowJo V10.5.2 (ver Figura suplementar). 12 para a estratégia de triagem / triagem). O número total de células viáveis para cada tecido após isolamento foi determinado por exclusão azul de tripan utilizando um hemocitómetro. O número total de células dentro de cada população leucocitária foi determinado utilizando a percentagem de células vivas para uma dada população celular, e o número total de células vivas contadas após o isolamento, que foi então normalizado para a mg de tecido ou mL de sangue colhido. Estratégia de galvanização: as células individuais foram classificadas com base em FSC-A e FSC-H. as células individuais vivas foram marcadas com baixa coloração para o Aqua Zombie vivo/morto. Desta população de células únicas vivas os leucócitos foram CD45+. Os subconjuntos leucocitários foram caracterizados da seguinte forma:: neutrófilos CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C baixa monócitos CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C alta monócitos CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, macrófagos CD45+CD11b+Ly6G−F480+, células T CD45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− e as células B CD45+CD11b−Ly6G−CD3−B220+. Note for blood F480 expression was not used in the gating strategy. Gates foi definido em relação aos controles isotipos.

os estudos cardiomiocitários neonatais

os miócitos ventriculares do rato neonatais (VNR) foram recentemente isolados utilizando um protocol68 estabelecido. Os ventrículos esquerdos recolhidos de ratos Sprague-Dawley de 2 dias de idade (Harlan) foram digeridos por tripsin (Biosciências de Amersham) e collagenase tipo II (bioquímica de Worthington). As células isoladas foram re-suspensas no meio m-199 (tecnologias de vida) complementadas com 10% de FBS, 19,4 mM de glucose, 2 mM de L-glutamina, 2 U/mL de penicilina, 0,8 µg/mL de vitamina B12, 10 mM de HEPES e 1 × MEM aminoácidos não essenciais (Sigma-Aldrich). Foram realizadas duas rondas de 60 min de pré-revestimento, durante as quais os fibroblastos cardíacos se ligam ao fundo do prato, enriquecendo assim a população não-diferente para os VNR. As células não-sequenciais (NRVMs) foram então semeadas nas diferentes matrizes de colagénio em placas de 24 poços (40 000 células/cm2). Para o ensaio de sobrevivência, os VNR cultivados durante 3 dias foram submetidos a um ensaio M-199 contendo 50 µM de peróxido de hidrogénio durante 3 h, após o que foi efectuado um ensaio Terminal de rotulagem em corte com dUTP-End de desoxinucleotidil transferase (TUNEL) e as células mortas foram contadas em três campos de visão aleatórios.

culturas celulares

usando um protocolo estabelecido, os macrófagos derivados da medula óssea foram isolados a partir de C57BL/6J mice69, de 8 a 12 semanas de idade. Os ratos foram eutanasiados por inalação de CO2 e luxação cervical, e os ossos da tíbia foram recolhidos e lavados com meios para isolar a medula óssea. O isolado de medula óssea foi pipetado repetidamente para obter uma suspensão de células únicas, que foi então passada através de um filtro de células. Células recém-isoladas foram cultivadas durante uma semana em DMEM complementadas com 10% de FBS, 20% de mídia condicionada por L929, e penicilina-estreptomicina, e depois re–banhadas no hidrogelo de rHC por 3 dias. As células foram recolhidas a partir dos hidrogels de rHC utilizando solução salina tampão CaCl2 de 3 mM contendo 250 unidades de colagenase I (Gibco). A polarização macrófaga foi avaliada por citometria de fluxo (FACS Aria III; Becton Dickinson) utilizando CD86 e CD206 (Biolegend) para identificar macrófagos M1 e M2, respectivamente. Para o isolamento de células mononucleares, a medula óssea dos ossos da tíbia foi coletada como descrito acima. As células mononucleares foram purificadas por centrifugação com gradiente de densidade utilizando Histopaque® (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram rotuladas com 0.5 µg/ml de DAPI (Sigma) durante 30 minutos a 37 °C.

o ensaio de aderência macrófago

as células mononucleares foram isoladas pelo rubor das tíbias e fémures de ratinhos de 6 a 12 semanas de idade. As células foram purificadas por centrifugação com gradiente de densidade utilizando Histopaque® (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. As células mononucleares foram contadas e rotuladas com DAPI. As células foram banhadas nos diferentes biomateriais a uma concentração de 50.000 células / cm2 para 24 h. as células foram fixadas com 4% PFA para 5 min, e as células foram contadas. Os dados foram expressos em relação ao controle (poços não revestidos, i.e., TCPS) para minimizar o efeito da variabilidade celular entre Doadores.As células mononucleares da medula óssea foram cultivadas em DMEM suplementadas com 10% de FBS, 20% de meio condicionado de L929 e Pen/Strep durante 7 dias para gerar macrófagos derivados da medula óssea (Bmdm) e rotuladas com DAPI, como descrito acima. As BMD (2 × 105) foram então re-suspensas em EBM sem fatores de crescimento e soro, e carregadas na câmara superior de uma placa de Transwell (tecnologias de vida) revestida com 100 µL de rHCI ou rHCIII. A câmara inferior continha meios de macrófago completos, como descrito acima. Após 24 h, as inserções foram removidas, e o número de Bmdm que migraram através do biomaterial foi quantificado de forma cega usando um microscópio fluorescente Zeiss Z1. Os dados foram expressos em relação ao controle (poços não revestidos, ou seja, TCPS) para minimizar o efeito da variabilidade celular entre Doadores.Foram geradas BMD em DMEM suplementadas com 10% de FBS, 20% de meio condicionado de L929 e Pen/Strep durante 7 dias, como descrito acima. Para experiências de activação de macrófagos, as células foram estimuladas durante 3 dias com lipopolissacárido (1 µg/ml; Sigma) mais IFN-γ (50 ng/ml; Sigma) para activação M1, ou com sistemas IL-4 (20 ng/ml; R&D) para activação do M2. O RNA total foi extraído usando reagente Tri (Zymo Research), De acordo com o protocolo do fabricante. O cDNA de primeira linha foi sintetizado com a transcriptase reversa de “Smartscribe” (Takara Bio USA) e os hexamer primers aleatórios (Fisher Scientific). Os níveis de mRNA do gene alvo foram avaliados pela RT-PCR quantitativa com SYBR Green I Mastermix (Roche) e um sistema de PCR em tempo Real LightCycler 480 (Roche). As sequências para os pares de iniciadores estão listadas no quadro suplementar 2. As alterações relativas na expressão do ARNm foram determinadas pelo método ∆∆ ∆ CT, expresso em níveis relativos a 18S. os dados foram expressos em relação ao controlo (poços não revestidos, ou seja, TCP) para minimizar o efeito da variabilidade celular entre dadores.

a sobrevivência após exposição a H2O2

as células foram cultivadas durante 7 dias em DMEM, complementadas com 10% de FBS, 20% de meio condicionado a L929 e Pen/Strep. No dia 7, o meio foi alterado para DMEM contendo 0,5 mM de peróxido de hidrogénio, e as células foram cultivadas durante 3 h antes de serem manchadas com 7-AAD para análise por citometria de fluxo. Os dados foram expressos em relação ao controle (poços não revestidos, ou seja, TCPS) para minimizar o efeito da variabilidade celular entre Doadores.

a análise estatística

a análise estatística foi realizada utilizando Kaleida Graph 4.5®. Todos os dados são apresentados como a média ± SEM. Para a comparação de Dados in vivo entre tratamentos, foi utilizada uma ANOVA seguida da correção de Holm para comparações múltiplas. O tamanho da cicatriz foi analisado usando uma regressão múltipla, incluindo o grupo de tratamento (rHCI, rHCIII e PBS) e a FEVE inicial. o rHCI e o rHCIII, em comparação com o PBS, eram indicadores significativos da dimensão do enfarte, para além da FEVE inicial. O coeficiente de correlação para o modelo é 0.6 usando regressão linear múltipla de STATA. Os dados in vitro de NRVM, macrófagos e fibroblastos cardíacos foram analisados quer por um teste t do estudante, quer por uma ANOVA de Sentido Único com uma correcção de Holm para comparações múltiplas, como especificado nas lendas da figura.O resumo dos Relatórios de investigação sobre a natureza, associado a este artigo, contém mais informações sobre a concepção da investigação.