Lacuna proteína de junção Connexin-43 é um regulador transcricional de N-cadherin in vivo

manipulação de Embriões

Adulto X. laevis foram mantidos no 17 °C e utilizado de acordo com os regulamentos do Serviço Biológico Unidade da University College London, em conformidade com o UK Home Office diretrizes estabelecidas nos Animais Act de 1986 como described45. X. os embriões de laevis foram obtidos e encenados tal como descrito anteriormente46,47. Para direcionar especificamente a crista neural, os embriões foram injetados nos blastômeros ventrais animais no estágio de oito células de um lado para todos os experimentos, exceto quando lisatos embrionários foram usados. Neste caso, os embriões foram injectados em ambos os lados animais de embriões em duas células. Microinjetões embrionárias foram realizadas de acordo com 48. Se necessário, fluoresceína-dextran (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) ou rodamina-dextran (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) foram utilizados como traçadores. Oligomorfolinos contra X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5′ – TTCCTAAGCACTCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAATGGTTTTCTGTGGTCGA – 3′) e BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′-AACGACGGGTTAAAGGCTCT-3′) foram sintetizados e fornecidos por ferramentas genéticas LLC. Foram utilizadas concentrações equimolares de morfolino de controlo padrão (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCATTCATTCTCC-5′). As quantidades de morfolinos correspondem às quantidades injetadas em um lado de embriões de oito células, enquanto o outro lado foi usado como um controle interno. Quando os embriões foram utilizados para a colheita de lisatos embrionários, foram injectados em duas células em ambos os blastómeros animais e o dobro das dosagens mencionadas foram utilizadas. Para testar a eficiência do Cx43MOs no ARNm cx43 endógeno, realizamos a análise western blot. Ambos os Cx43MOs baixaram eficientemente os níveis proteicos do cx43fl e Cx43iso endógeno(Fig. 3a, b). A fim de validar a eficiência do BTF3MO, testamos através da imunocontração das células da crista neural a expressão da proteína BTF3, que mostrou níveis reduzidos de BTF3 nas células BTF3MO em comparação com o CTLMO (Fig. suplementar. 3a).

hibridização in situ foi realizada como descrito anteriormente 49, 50. Brevemente, os embriões foram fixados em MEMPFA, seguidos de hibridação nocturna com sondas marcadas com digoxigenina, incubados com um anticorpo AP e actividade AP foi desenvolvida utilizando substratos NBT/BCP. Digoxigenin rotulados de sondas de RNA foram preparados para foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22), e sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (de 0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml), e de torção (de 0,7 µg/ml) foram utilizados para avaliar a crista neural de indução, de torção (0.7 µg / ml) para a migração da crista neural, n-cadherina (1 µg/mL) para avaliar os níveis de expressão e o padrão de expressão btf3 (0, 7 µg/mL). Foi efectuada imunossupressão de Monte inteiro, como descrito anteriormente55, utilizando anticorpos Cx43 (1: 1000, Sigma, C6219). Brevemente, os embriões foram fixados em MEPMFA e incubados durante a noite com o anticorpo na diluição descrita.

os explantes da tampa Animal foram dissecados a partir de Xenopus blastulas (fase 8) usando uma tecnologia padrão 48,56 e preparados para hibridização in situ como descrito acima. Para os testes da tampa animal, foram injectados 500 pg de ARNm no lado animal dos dois blastómeros de embriões de duas células. A análise da ISH foi realizada em 20-25 embriões por Condição para cada experiência independente.Os transplantes de crista Neural foram efectuados Como anteriormente relatado57. Brevemente, a crista neural retirada do estágio 18 embriões fluorescentemente rotulados foram dissecados com facas de sobrancelhas e enxertados em embriões hospedeiros não marcados. Para experiências in vitro,os explicadores da crista neural craniana foram dissecados na fase 18 usando uma tecnologia padrão 58, 59 e banhados em pratos revestidos de fibronectina (Sigma, F1141), como descrito anteriormente 53. Para testes de células únicas, as células da crista neural foram brevemente dissociadas em Danilchick medium53 livre de Ca2+/Mg2+. Para cada condição, dez embriões transplantados com fluorescentes marcados com NC foram analisados por experiência.

Imunocontinuição foi efectuada em explantes da crista neural, tal como descrito anteriormente 54 usando anti-n-cadherina (1: 50, IGG rato, MNCD2 clone, DSHB), anti-e-cadherina (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. A imagem da migração da crista neural in vitro foi realizada usando a cinematografia de tempo-lapso, como descrito anteriormente53, 60. Brevemente, as células da crista neural foram cultivadas em placas de petri de plástico ou vidro revestidas com fibronectina, e a microcopia do tempo foi iniciada após uma hora de cultura in vitro. Para motilidade celular e migração, microscópios compostos (ou um microscópio Nikon Eclipse 80i com uma câmera digital Hamamatsu ou um microscópio Leica DMRXA2 com uma câmera Digital Hamamatsu controlada por um simples programa PCI) equipados com estágios motorizados e uma lente de 10×/0,30 na Seco foram usados. As culturas NC foram preparadas tal como acima descrito. As imagens foram adquiridas a cada 5 minutos por um período de 12 h. Para A imagem morfológica celular, foi usado um microscópio TCS SP8 com uma lente objetiva de imersão em água 63 × /0.90 NA e controlada por software LAS–AF. As células fixas foram fotografadas utilizando um objectivo de imersão em óleo de 63 × /1,4 na e um microscópio confocal confocal de Leica TCS SPE controlado por software LAS–AF.

para localização da construção ou níveis endógenos se, 10-15 NCC foram analisados para cada condição por experiência.

a migração celular e a análise morfológica celular

o ensaio de quimiotaxia foi realizado de acordo com um procedimento padrão 61 utilizando contas acrílicas de heparina (Sigma, H5263) revestidas com 1 µg/mL de factor-1 derivado de células estromais humanas purificadas (Sigma, SRP3276). Motilidade celular e quimiotaxia foram analisadas usando ferramentas de análise ImageJ (https://imagej.nih.gov), como descrito anteriormente53, 60. Brevemente, cada célula individual foi monitorada manualmente usando o plugin de rastreamento Manual do ImageJ, os dados foram coletados e analisados usando o plugin de quimiotaxia do ImageJ. A morfologia celular foi avaliada pela implantação do Índice de circularidade (círculo completo = 1) e estimada por ferramentas de análise ImageJ. A dispersão celular foi analisada usando o algoritmo de triangulação de Delaunay (Plugins ImageJ) e foi plotada como área de triângulo explicante médio, como descrito antes de 54. A área protrusiva celular foi analisada em células de crista neural na borda de um explicante que mede a área de crescimento que deriva de dois períodos consecutivos com 4 minutos de intervalo de tempo; estes dois quadros consecutivos foram subtraídos para gerar a nova área 12. Para análise de quimiotaxia celular e dispersão celular 10-15 explantes foram analisados por Condição para cada experimento independente. Para a motilidade celular, morfologia celular e saliências celulares 15-25 NCC foram analisados por condição por experiência.

Biologia Molecular, plasmídeos e reagentes

para a síntese de cDNA, o RNA total foi isolado a partir de 10-15 fases de embriões 23-24 ou 10-15 fase de cápsulas de origem animal a partir de X. laevis por Condição para cada experiência independente e foram utilizadas três réplicas técnicas em cada experimento25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) como modelo. Comprimento total Cx43 (Cx43FL, aa 1-379), Cx43 carboxy terminais truncado construir (Cx43Trunc, aa 1-212) e Cx43-20k construir (Cx43Tail, aa 213-379) foram clonados em 5’BamHI/3’XhoI de pCS2+ ou pCS2-EGFP vetores. O vector pCS2-EGFP foi gentilmente fornecido pelo Dr. Masa Tada. A construção indutível do Cx43Tail foi preparada fundindo o cx43-20kTail (aa 219-379) ao Domínio ligante do GR humano (aa 512-777). O Cx43-20k foi clonado em 5’Ecori / 3’ACI e GR em 5’Aci / 3 ‘ Xhoi de pCS2+ e pCS2-EGFP. As construções BTF3 foram sintetizadas usando o X. laevis sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.3536). A BTF3FL (aa 1-162) foi clonada em 5’Ecori/3 ‘ Xhoi de pCS2+ ou pCS2-EGFP. BTF3 deletation construct lacking the NLS region RRKKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) was cloned into 5’Bamhi/3 ‘ Clai of pCS2+. Para as experiências BiFC (Fig. 4b, c), Cx43Tail e Cx43Trunc foram clonados em 5’BamHI/3’BamHI de pCS2-VC155. BTF3FL foi clonado em 5 ‘Bamhi / 3’ Bamhi de vetores pCS2-VN9m. BiFC foram gentilmente fornecidos pelo Prof. James C. Smith. Todas as sequências de construção são verificadas por sequenciação automatizada de ADN (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg/embrião,63).

toda a análise de construções fluorescentes foi avaliada normalizando a fluorescência de fundo e, quando necessário, a fluorescência total da área celular.Foram utilizados os seguintes reagentes:: flufenamic ácido (50 µM por NC de explante de incubação −100µM para o embrião tratamento, Sigma, F9005), meclofenamic ácido (50 µM por NC de explante de incubação −100µM para o embrião tratamento, Sigma, M4531), actinomycin D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) e de etanol dissolvido, dexametasona (10 µM) foi adicionado ao meio de cultura em fases 14-15 e mantida até a crista neural migratórias estágios embrionários (fase 23). Para controlar a possível fuga de quimeras indutíveis, um lote de embriões aparentados foi cultivado sem Dexametasona e processado para hibridização in situ. Para o ensaio de acoplamento (testing gap junction channel activity), foram analisados 10-15 NCC por condição por experiência.

Immunoprecipitation, fraction, and western blotting

For each condition 10-15 embriões were used for preparation of embryo lisates per experiment. Todo embriões foram preparados por western blot após homogeneização em tampão de lise (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,01% De Triton-X, pH 8,0), com adição de inibidores de protease (Roche, 11836153001) e fosfatase inibidores (Roche, 04906837001)54,64. Para blots ocidentais, foram utilizados os seguintes anticorpos:: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); brevemente, as células foram suspensas em tampão de lise e centrifugadas a 20 000×g durante 5 minutos a 4 °C, o sobrenadante foi recuperado e o volume ajustado com tampão de diluição. As contas foram equilibradas em tampão de diluição e misturadas com o lisato da célula ressuspensa. A mistura foi magneticamente purificada e preparada para western blot. O isolamento de fração Nuclear de embriões X. laevis foi realizado usando protocolos de centrifugação diferencial com modificações 64, 65. Brevemente, Fase 18 X. lisatos embrionários de laevis utilizando uma agulha de 22 G e um tampão de homogeneização de 20 µL (HB: 250 mM de sacarose, 20 mM de Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, fosfatase e inibidores da protease) por embrião. Todas as amostras foram centrifugadas a 250×g durante 5 minutos para remover detritos embrionários. Após a recolha do sobrenadante, foi distribuído em três tubos diferentes e rodado a três velocidades diferentes (400×g, 600×g) durante 5 minutos para isolar os núcleos celulares. Os sobrenadantes pós-nucleares foram mantidos para posterior processamento. Os pellets nucleares foram lavados novamente em tampão HG e centrifugados à velocidade adequada (400×g, 600×g). Os pellets nucleares foram então ressuspendidos em 40 µL 10% de glicerol/0, 1% SDS/1% Triton-X em HB. Foi adicionada a cada amostra uma quantidade adequada de tampão de amostra, tendo as amostras sido processadas para a electroforese em gel de acrilamida e para a análise da Mancha ocidental. A fim de evitar erros de carga, a mesma membrana foi blotada contra o controle de carga após a remoção,como descrito antes 54, 64.

os dados Western blot foram analisados usando ferramentas de análise ImageJ. As intensidades de imagem foram normalizadas e a razão entre a proteína de interesse para o controle de carga (i.e.(Mapk ou α-tubulina) foi calculado, foram traçados rácios médios. As blots não cortadas são incluídas como números suplementares (figos suplementares. 5–7).

culturas de Células

células HeLa (Instituto Leibniz de Coleções de Microrganismos e de Células de Cultura, DSMZ, Alemanha) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (Life Technologies, CA, EUA) a 37 °C em uma umidificado atmosfera de 10% de CO2 e transfected como indicado usando Rotifect (Carl Roth, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante.

os fibroblastos embrionários de Xenopus (XTC, uma dádiva gentil de Ana Losada) foram cultivados em 67% DMEM/H2O, complementados com 10% de soro fetal de vitelo a 25 °C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 e transfectados como indicado usando Viafect (Promega, EUA). Plasmídeos para transfecção foram como indicado e 10-20 células Hela ou XTC foram analisadas para cada condição por experiência.

para experiências siRNA, uma combinação de três siRNA direcionados contra BTF3 foram transferidos como descrito acima. Um siRNA padrão (scrambled siRNA from Sigma) foi usado como um controle. O número de catálogo para estes siRNA comercial contra BTF3 são: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. As células foram recolhidas 48 horas após transfecção e processadas para experiências com qPCR, western blot ou Immunohistochemestry. Conforme descrito nas respectivas secções.Todas as linhas celulares foram testadas para detecção de contaminação por micoplasma.

Immunohistochemestry e a faloidina coloração

Para detecção de proteínas, células de mamíferos ou crista neural explantes foram fixados em 4% de formaldeído em 0,2% em PBS-T (PBS + 0,2% de Triton X-100) por 10 min e bloqueado com 10% NGS para 1 h. Os anticorpos primários foram incubados a 4 ° C em 10% de NGS. Os seguintes anticorpos foram utilizados: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), de 2,5 µg/ml de anti-N-cadherin (MNCD2 Desenvolvimento de Estudos de Hibridoma Banco), e 1:100, anti-Cx43 (Sigma, C6219), em 10% NGS e incubado EM a 4 °C. Explantes foram lavados 3 vezes com PBS + 0,2% de Tween-20 e incubado EM a 4 °C com o anticorpo secundário, diluído a 1:350 em 10% NGS. O DAPI foi diluído às 1: 1000 e misturado com os anticorpos secundários.

espectrometria de Massa

Para co-imunoprecipitação da BANDEIRA-tagged Cx43Tail de espectrometria de massa para análise de células foram lisadas e os lisados foram incubadas durante a noite com anti-HA e equilibrada a alta afinidade de contas, a 4 °C, o immunoprecipitates, em seguida, foram lavados e eluted27. Subsequentemente de eluição ácida com 0, 1 M de pH glicina 2, 5, o pH dos eluatos foi ajustado para pH 8, 0 com 0, 5 m de Tris. No caso das amostras de digestão proteica, foram incubadas de um dia para o outro com 2 µg de tripsina (Tripsin Gold, Promega, EUA), seguido da adição de 0.1 µg de Lys-C (Roche, Alemanha) e incubação para 6 h. os peptídeos foram dessalinizados em pontas de fase invertida C-18 (Nest Group, EUA), secos no vácuo e armazenados a -20 °C até análise. As misturas de péptidos secos foram recuperadas em 3 µl de ácido fórmico a 30% e diluídas com água a 23 µl. Cinco µl do resumo foram injetadas em um Nano-LC (sistema de Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, EUA) e peptídeos foram separados por cromatografia de fase reversa C-18 colunas preparadas em casa (Reprosil-Pur C18-AQ, de 1,9 µm, Dr. Maisch, Alemanha, PicoFrit Colunas, 75 µm eu.d., Novo Obejctive, EUA) em um gradiente linear de 100% eluente a (0,1% ácido fórmico) a 55% eluente B (60% actenitrilo, 0,1% ácido fórmico) em 120 minutos. O sistema LC foi configurado como coluna desgastada e a amostra foi carregada e dessalinizada a um caudal de 400 nl/min e a separação foi efectuada a um caudal de 200 nl/min. O sistema nano-LC foi hifenado ao espectrômetro de massa (Q-Exactive HF, Termocientífico, Alemanha) que foi operado em modo dependente de dados. A interpretação de dados foi realizada com Mascot V2. 2 (Matrixscience, Reino Unido) e Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, Reino Unido). A interpretação de dados foi realizada com MaxQuant V1.6. 1. 0 e Perseus V1.6.1.3 (MPI de Bioquímica, Alemanha).O ensaio de Acoplamento

o ensaio de Acoplamento

comunicação intracelular de junção Gap foi testado utilizando um ensaio de acoplamento de Corante. Aqui, o corante fluorescente Calcein-AM (Sigma, 17783) foi usado. Uma população de crista neural dissecada de embriões não expulsos foi incubada com o corante Calceína-AM por aproximadamente 10 minutos ou até que o corante foi carregado em todas as células. Outra população de crista neural de embriões injectados com um marcador nuclear (injeções nRFP mRNA, ver acima) foi dissecada separadamente. Após a dissociação das duas populações na ausência de cálcio e magnésio, estas foram misturadas e incubadas durante 1 h a 14 °C num tubo de ensaio. Após a centrifugação leve, as explantes da crista neural foram cortadas em peças de tamanho semelhante e cultivadas como descrito acima e então filmadas. Para testar a actividade do canal, foram utilizados junções de gap, bloqueadores de gap; ácido meclofenâmico (Sigma, M4531) e ácido flufenâmico (Sigma, F9005). A comunicação celular foi avaliada estimando a relação entre o número de células que apresentam tanto marcadores como marcador nuclear e a Calceína e o número total de células que possuem o marcador nuclear.

análise estatística

a estimativa do tamanho da amostra foi feita após trabalhos publicados anteriormente e não foi utilizado nenhum método estatístico específico. Os experimentos não foram randomizados e devido à natureza dos experimentos, os autores não foram cegos para a alocação durante ambos, experimentos e análise de resultados. Só foram analisados embriões e explantes viáveis. Embriões injetados em Mis não foram incluídos em experimentos de hibridação in situ. A injecção correcta foi determinada pela injecção de marcadores lineares. Os nossos parâmetros experimentais foram medidos aleatoriamente, uma vez que embriões viáveis e devidamente injectados foram seleccionados.

a comparação das percentagens foi realizada utilizando quadros de contingência 66. A normalidade dos conjuntos de dados foi testada usando o teste de Kolmogorov-Smirnov, o teste de D’Agostino e o teste de Pearson e o teste de Shapiro–Wilk usando Prism6 (GraphPad). Conjuntos de dados seguindo a distribuição normal foram comparados com o teste – t do Estudante (variâncias desiguais de duas caudas) ou ANOVA com comparações múltiplas de Dunnett pós-teste usando o Excel ou Prism6 (GraphPad). Conjuntos de dados que não seguiram uma distribuição normal foram comparados usando o teste de Mann Whitney ou uma ANOVA não-paramétrica (Kruskal Wallis com múltiplas comparações de Dunn pós-teste) usando o Excel ou Prism6. As comparações cruzadas só foram efectuadas se o valor p Global da ANOVA fosse inferior a 0, 05. Em todas as figuras lendas N = Número de experimentos independentes; n = Tamanho total da amostra.

X. laevis n-cadherin identificação do promotor parcial

para identificar o promotor básico de Xenopus n-cad usámos a seguinte estratégia. A região promotora básica dos genes n-cadherin de pintos e mamíferos foi descrita nas regiões 5′-UTR, na posição -3000 a -1 bp,respeitando o site41, 67 de iniciação da tradução. Utilizando o recurso do projecto genoma X. laevis (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/), identificámos uma região de 2800 bp no 5′-UTR do gene X. laevis n-cadherin (Figo suplementar. 4). Uma vez que os nossos dados indicam que o Cx43Tail, o BTF-3 e o Pol II formam um complexo, usamos o elemento tool68 para procurar caixas TATA potencialmente ativas na região que isolamos. A nossa análise in sílica revela uma região rica em caixas de TATA entre as posições -166 a -618 bp, em relação ao site de início da tradução (Fig suplementar. 4). Finalmente, nós projetamos primers sobrepostos para amplificar fragmentos de 200 bp em toda esta região. As sequências de iniciadores estão listadas na seção de chips e suas regiões de ligação são destacadas em Figo suplementar. 4.

imunoprecipitação da Cromatina (ChIP)

Para imunoprecipitação da cromatina (ChiP), segue um procedimento padrão para X. laevis embryos69,70. Para cada experiência independente usamos duas réplicas técnicas e 250-300 embriões Xenopus por condição. Os embriões de laevis foram fixados para 15 min e 3 µg de anticorpo Pol II (Diagenode, C15100055) ou anticorpos de ChIP GFP (Abcam, ab290). Para extração de DNA seguimos um protocol69, 70. Usando o recurso de Análise de elementos, procuramos por caixas de dados putativos no X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTCCCTTTTTTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTCTTGTC-3′,

P8R: 5′-AGTCTTTAGAGACAACG-3 ‘

e os seus locais de ligação relativos são apresentados na figura complementar. 4B. as experiências com ChIP foram quantificadas da seguinte forma: a razão normalizada de intensidade de banda para cada condição foi calculada em média e o aumento de dobra respeito o controle IgG foi calculado e plotado como enriquecimento dobrado. A intensidade da banda foi registrada usando o plugin de análise ImageJ Gels. Géis não cortados são mostrados em figos suplementares. 7c, D.