Mínimo de Informações para os Relatórios sobre a Comet Assay (MIRCA): recomendações para descrever cometa procedimentos de ensaio e os resultados

O MIRCA diretrizes foram criados por membros da hCOMET CUSTO de Ação com o objetivo de melhorar a geração de relatórios e análise de resultados do ensaio cometa (http://www.hcomet.eu/). Os autores são especialistas em cometas com um mínimo de oito anos de experiência com estes ensaios (15 dos autores têm >20 anos de experiência relevante). Usamos um questionário baseado na internet para amostrar opiniões dos autores sobre a importância dos detalhes de Relatórios (Tabela 1; dados suplementares). Cada informação foi classificada pelos autores como “essencial”, “desejável” ou “não importante”, e um limiar de ≥75% de congruência foi usado para as classificações. Se o número de respostas “informações essenciais” não atingir o limiar de 75% de acordo, as respostas “informações essenciais” e “informações desejáveis” Foram combinadas, e o pedaço de informação foi classificado como “informações desejáveis” se ≥75% dos autores concordaram que era “essencial” ou “desejável”. No quadro 1, são incluídas notas explicativas para cada recomendação.

recomendações específicas MIRCA para cada etapa do ensaio comet

etapa 1A: Isolamento das células e preparação de suspensões de células únicas

à medida que o ensaio comet utiliza suspensões de células únicas, As amostras que não são obtidas como células únicas devem ser tratadas mecanicamente ou enzimaticamente para perturbar a ligação das células a uma matriz extracelular ou uma à outra. A homogeneização dos tecidos por ruptura mecânica pode, por si só, causar danos ao ADN, enquanto a digestão enzimática dos tecidos pode levar à remoção de lesões do ADN devido à actividade das enzimas endógenas de reparação do ADN, ou aumentar os níveis de danos do ADN libertando nucleases das células. A composição do tampão de homogeneização é uma informação “desejável”, especialmente no que diz respeito aos componentes necessários para preservar a integridade do ADN (por exemplo, ácido etilenodiaminotetraacético)24,25. Uma descrição do procedimento para o isolamento de suspensões unicelulares, incluindo a homogeneização do tecido, é considerada como informação “desejável” a reportar em artigos.

amostras de sangue são frequentemente utilizadas em estudos de biomonitorização humana. Dado que o sangue representa uma população heterogénea de células, as publicações “são essenciais” informações pormenorizadas sobre a população celular. O texto deve descrever com precisão se os espécimes são sangue inteiro (incluindo glóbulos vermelhos), leucócitos, células mononucleares ou um subconjunto de células (por exemplo, linfócitos). Pode também ser útil incluir informações sobre o procedimento para a venopunctura, tipo de anticoagulante e subsequente método de isolamento celular (isto é, centrifugação e etapas de lavagem) para aqueles que repetem a experiência, de modo que esta é classificada como informação “desejável”. Informações sobre as condições de armazenamento das células ou tecidos se eles são criopreservados, bem como o método de congelamento (por exemplo, snap congelamento em gelo seco ou nitrogênio líquido, ou um lento processo de congelamento) e descongelamento procedimento, é considerado como “essencial” informações para o relatório, como esses processos têm sido mostrados para afetar o nível basal de DNA migration26.

passo 1B: Preparação de células substrato para o ensaio in vitro de reparação de ADN

qualquer tipo de célula eucariótica pode ser utilizado como célula substrato para o ensaio in vitro de reparação de ADN, e o tipo e a densidade celulares são informações “desejáveis” a comunicar. É “essencial” comunicar o método e o tipo de composto genotóxico utilizado para induzir lesões do ADN nas células do substrato e Condições subsequentes de armazenamento de células, enquanto que o nível total de lesões do ADN que podem ser detectadas nas células do substrato (por exemplo:, o número de locais sensíveis à formamidopirimidina ao ADN glicosilase em células tratadas com Ro19-8022 mais luz) é considerado apenas como informação “desejável”.

Step 1C: controlos do ensaio

neste artigo, os controlos do ensaio referem-se a amostras incluídas em cada experiência do ensaio comet; estas são por vezes designadas por normas de referência, controlos internos ou Controlos técnicos 16,27. Os controles de doseamento são tipicamente alíquotas criopreservadas de um único lote de células que foram expostas a um agente de quebra de cadeia de DNA (ex.* radiação ionizante, peróxido de hidrogénio ou metanossulfonato de metilo) ou um tratamento que provoca um tipo específico de lesão de ADN (por exemplo, o tratamento fotossensibilizador Ro19-8022 mais leve, ou bromato de potássio, para induzir oxidação do ADN). Existem diferentes controles de ensaio para o teste padrão do cometa alcalino e o teste do cometa modificado por enzimas. O composto utilizado para o ensaio enzimático modificado não deve gerar quebras da cadeia de ADN, uma vez que estas diminuem a gama dinâmica dos locais sensíveis às enzimas. Nos estudos de biomonitorização, bem como nos estudos transversais, intervencionais e clínicos, as células não expostas podem ser utilizadas como controlo doseamento. É “essencial” comunicar os níveis de danos nos controlos do ensaio e na variação do ensaio (desvio-padrão) tanto no ensaio comet normalizado como no ensaio Comet modificado pelas enzimas.

o ensaio in vitro de reparação de ADN utiliza controlos experimentais internos, que também são utilizados no cálculo da actividade de reparação, em vez dos controlos do ensaio propriamente ditos. Ele é ‘essencial’ informações para relatar o nível de reparo de DNA incisões na nucleoids a partir de (i) não-expostos substrato de células incubadas com tampão de reação, para determinar o nível basal de danos no DNA em substrato de DNA (por exemplo, o “plano de controlo”); (ii) expostos células incubadas com a reação do buffer, para revelar o nível de qualquer inespecíficos DNA quebras ou local abásico sites resultante do tratamento com a danificação do agente (por exemplo, o ‘tratamento’); iii) células de substrato não expostas incubadas com extracto proteico da amostra, para verificar a incisão não específica ou a actividade de clivagem (isto é, o “controlo de especificidade”); e IV) células de substrato expostas incubadas com uma enzima específica da lesão, semelhante aos controlos doseamento para o ensaio Comet modificado pelas enzimas (isto é, o “controlo da reacção de incubação”).

etapa 1D: controlos negativos e positivos

neste artigo, os controlos negativos e positivos referem-se aos grupos experimentais, tal como descrito na norma orientadora da OCDE (TG 489) para o ensaio comet in vivo em tecidos animais 18. Assim, os controlos negativos e positivos dizem respeito a toda a experiência. Um controlo positivo refere – se a um composto genotóxico de acção directa ou indirecta que produz quebras da cadeia de ADN ou locais sensíveis às enzimas detectados com o ensaio comet. No que respeita ao ensaio Comet modificado por enzimas, não existe uma lista de controlos positivos que corresponda aos compostos que a OCDE apresenta como controlos positivos para o ensaio Comet alcalino (para induzir quebras da cadeia de ADN) em tecidos animais específicos. Além disso, não existe um controlo positivo para os estudos de biomonitorização humana, uma vez que as pessoas saudáveis não podem ser deliberadamente expostas a um agente genotóxico. Os controlos positivos são já considerados obrigatórios em experiências de cultura celular em toxicologia genética e serão de facto informações “essenciais” nos artigos que utilizam o ensaio comet. Em estudos em animais, no entanto, para fins práticos, os dados de cometas sobre controles de ensaio (i.e., as amostras mencionadas na secção anterior intitulada “Fase 1C, controlos doseamento”) são suficientes, enquanto os resultados dos controlos verdadeiros negativos e positivos são considerados apenas informações “desejáveis”.

Step 2: Embedding of the cells in agarose

the comet assay was originally developed using three layers of agarose on glass slides, with the middle layer containing the cells. No entanto, a camada superior de agarose não é necessária, e certos procedimentos não usam uma camada inferior (por exemplo, testes de película Gelbond). É “desejável” relatar o tipo de diapositivos e tamanho (i.e., área de superfície) dos géis, como a proporção das células perto da borda do gel aumenta à medida que o tamanho do gel diminui e o DNA nos nucleóides na borda do gel pode migrar diferentemente do que nos nucleóides para o centro do gel22. A concentração final de agarose (com as células nelas incorporadas) é “essencial” para relatar, uma vez que a migração do ADN depende da densidade do gel.

Passo 3: lise das células

existem vários procedimentos para lisagem de células no ensaio comet. A informação sobre a composição da solução de lise é “essencial”. Pode ser necessário um passo adicional de incubação enzimática (por exemplo, com proteinase K) para certos tipos de células, e os detalhes da incubação também devem ser declarados como informações “essenciais”. Alguns relatórios sugerem que a duração da lise pode afectar a estabilidade de certos tipos de ADN lesionos28,29,30, pelo que a duração da lise e a temperatura da solução de lise São informações “desejáveis” a comunicar.

passo 4A: Tratamento enzimático de reparação no ensaio Comet modificado por enzimas

uma vez que a solução de lise pode inibir a actividade da enzima de reparação, é “desejável” estabelecer se foi realizada uma etapa de lavagem entre a etapa de lise e o tratamento enzimático (isto é, a composição do tampão de lavagem, o número de lavagens e a duração). É “essencial” transmitir informações sobre a fonte das enzimas de Reparação, uma vez que foi demonstrado que as enzimas de diferentes fabricantes diferem tanto na sua actividade como na sua especificidade em relação às nucleobases lesionas16. Na maioria cometa estudos, a titulação curva de experimentos são realizados para identificar as condições ideais para a enzima treatment31; no entanto, os resultados da enzima titulação curvas são raramente relatados e são aqui classificados como “desejável” de informações (referência a um estudo anterior poderia ser feito em vez disso), apesar de a considerar como ‘essencial’ para relatar a duração e a temperatura do tratamento. A concentração da enzima aplicada ao gel é informação “essencial”; é preferível comunicar a concentração em unidades enzimáticas (U/ml), embora a concentração de proteínas (mg/ml) também seja útil. O tipo de unidade de incubação (por exemplo, incubadora, fosso de lâmina ou sistema de 12 gel) e o modo de incubação são informações “desejáveis” a comunicar. Deve indicar-se se a incubação foi realizada (i) num banho de enzimas ou com uma gota e um tubo de cobertura na lâmina, (ii) numa versão padrão de 2 gel, 12 gel ou sistema de poços múltiplos ou (iii) numa caixa humidificada numa incubadora, numa placa de aquecimento ou num fosso de lâmina aquecido.1800 passo 4B: Preparação e incubação de extractos para o ensaio in vitro de reparação de ADN

é “desejável” comunicar o número de células ou a massa de tecidos utilizados na preparação dos extractos proteicos, sendo “essencial” comunicar a concentração final de proteínas de extractos celulares ou de tecidos que é adicionada ao ADN substrato. A composição do tampão de extracção (informação “desejável”) é menos crucial do que a composição do tampão de incubação (informação “essencial”), uma vez que este último pode afectar o nível de base da migração de ADN. De acordo com a informação relativa ao ensaio Comet modificado pelas enzimas, é “desejável” comunicar os resultados de experiências de titulação ou de estudos anteriores de referência do mesmo laboratório, nos casos em que tenham sido realizados. O volume de extracto adicionado às células de substrato embebidas em gel é informação “desejável”. É “essencial” comunicar a duração e a temperatura do período de incubação, uma vez que afectam o número de incisões de reparação. Quanto ao ensaio Comet modificado por enzimas, o modo de incubação é informação “desejável” a comunicar para o ensaio de reparação in vitro. As informações sobre a identidade da enzima utilizada como controlo da reacção de incubação (indicando a quantidade de lesões do ADN nas células do substrato) e a composição do tampão utilizado para o nível de fundo das incisões de reparação do ADN nas células do substrato não expostas são “essenciais”, uma vez que são fundamentais para demonstrar a fiabilidade da actividade de incisão de reparação do ADN.

Passo 5: tratamento alcalino

a solução de elevado pH alcalino perturba a ligação do hidrogénio que mantém as cadeias de ADN Unidas e também converte certas lesões das nucleobases em fracturas da cadeia de ADN. Assim,a duração do tratamento alcalino pode afetar o nível de migração do DNA na eletroforese subsequente 32,33, 34. As informações específicas relativas à composição da solução alcalina, ao pH, à temperatura e à duração do tratamento são, por conseguinte, informações “essenciais” a comunicar.

Passo 6: electroforese

os motores mais importantes da migração do ADN são a duração da electroforese e o potencial eléctrico (queda de tensão na plataforma do tanque de electroforese)35. É “essencial” que sejam comunicadas a composição do tampão de electroforese, a resistência da electroforese [gradiente de tensão (V/cm) sobre a plataforma do reservatório de electroforese] e a duração da electroforese. A alta temperatura durante a eletroforese pode afetar a migração do DNA 36; assim, a informação sobre a temperatura da solução de eletroforese é “essencial”, e isso pode ser acompanhado por descrições das medidas tomadas para manter a constante de temperatura (por exemplo, resfriamento da plataforma ou circulação do tampão).1800 passo 7: Neutralização

esta etapa envolve a remoção do excesso de solução alcalina das lâminas para garantir uma coloração eficiente. É “desejável” descrever a composição da solução de neutralização.

Step 8: coloração e visualização

corantes de ligação ao ADN têm afinidades de ligação diferentes ao ADN e podem,portanto,afectar o cálculo dos descritores do ensaio comet primário em software de análise de imagens diferentes36, 37, 38. O tipo de corante é informação “essencial”, enquanto a concentração é informação “desejável”, assim como o tempo entre coloração e visualização. A intensidade da luz de diferentes tipos de lâmpadas de microscópio difere. Além disso, varia em função da Idade da lâmpada e do Tempo em que foi ligada durante a contagem dos cometas. No entanto, não existe um procedimento padrão para medir a intensidade da luz e corrigir o nível de migração do ADN em conformidade. Além disso, o mesmo cometa pode parecer ter diferentes níveis de migração de DNA em diferentes magnificações do microscópio. Assim, é “desejável” relatar a ampliação do microscópio utilizada para a pontuação. É “desejável” mostrar imagens representativas de cometas (e.g., controle com pouca ou nenhuma migração, migração moderada e extensa de DNA), juntamente com os níveis relatados de migração de DNA.

Step 9A: Scoring and data analysis

this step requires the reporting of “essential” information for the primary comet assay descriptor (e.g.. %De DNA na cauda, comprimento da cauda, momento da cauda ou escore visual), o número de cometas que são analisados por amostra e como o nível geral de migração do DNA é expresso (por exemplo, mediana ou média de escores de cometa). Não é “importante” relatar o resultado individual de cada cometa em cada gel; eles são combinados para calcular o nível geral de danos. Como não pode ser descartado que diferentes pacotes de software de análise de imagens podem ter diferentes maneiras de calcular o predictor do ensaio Comet primário, é “essencial” relatar o software utilizado (nome do software, Fabricante, versão). Todos os principais descritores de compartilhar a limitação de que é necessário ter experiência na comet assay para entender o que eles significam, enquanto que se uma curva de calibração é criado (utilizando a radiação ionizante, que induz quebras em uma frequência conhecida), os resultados podem ser convertidas em relação lesão frequência comparado a inalterados os nucleotídeos ou nucleobase pares; tais dados são inequívocos e passar a informação de que todos os pesquisadores podem understand39. O procedimento para obter uma curva de calibração, utilizando radiação ionizante, e converter os níveis de migração do ADN para a frequência das lesões em relação aos nucleótidos ou pares de nucleobases não esterilizados foi anteriormente relatado40. Assim, a comunicação dos resultados como níveis de lesões por 109 nucleótidos inalterados ou 106 pares de nucleobases é “desejável”.1800 passo 9B: Cálculo de locais sensíveis às enzimas ou número líquido de incisões no ADN do substrato para o ensaio in vitro de reparação do ADN

a incubação com enzimas de reparação do ADN aumenta o nível de migração do ADN, uma vez que tanto o nível basal de quebras da cadeia de ADN como as lesões específicas das enzimas contribuem para o número total de quebras da cadeia de ADN. Uma vez que a migração do ADN que é atribuída ao nível basal de lesões do ADN e de lesões específicas das enzimas pode ter origem em diferentes mecanismos de genotoxicidade, é insuficiente comunicar apenas o nível total de danos do ADN após o tratamento enzimático. Em vez disso, é “essencial” comunicar a genotoxicidade como locais sensíveis às enzimas, onde o nível basal de migração de ADN foi subtraído da migração de ADN nas lâminas tratadas com enzimas.

uma vez que o ensaio in vitro de reparação de ADN utiliza as mesmas células substrato com todas as amostras de extracto de células ou de tecidos, não é necessário que cada amostra seja submetida a controlos de fundo e de tratamento simultâneos no mesmo ensaio (isto é, Ensaio). Pode haver mais de um substrato (e.g., ao analisar a atividade de reparo de excisão de base e nucleótidos) e, portanto, controles separados para cada tipo de teste de reparo de DNA são necessários. É “essencial” comunicar as incisões líquidas através do extracto de reparação no ADN do substrato.

passo 9C: a análise estatística dos resultados

as análises estatísticas são “essenciais”. O tipo de análise estatística depende da concepção do estudo e segue os pressupostos gerais dos ensaios estatísticos em toxicologia genética e biomonitorização 41,42.