O colágeno tipo III é crucial para o colagénio eu fibrillogenesis e para o normal desenvolvimento cardiovascular

RESULTADOS E DISCUSSÃO

ES (J-1) células (22) foram transfected com uma segmentação vetor contendo um Col3a1 gene do DNA genômico fragmento em que a região promotora do gene e o primeiro éxon codifica o peptídeo sinal foram excluídos (Fig. 1A). Clones de células ES específicos foram identificados pela análise de blot Sul e utilizados para injeção de blastocisto(Fig. 1b superior). Ratos mutantes foram derivados de dois clones de células ES de alvos independentes e identificados pela análise de manchas do Sul(Fig. 1B mais baixo). A análise proteica do colagénio da cauda e da pele mostrou que os ratinhos mutantes heterozigóticos apresentam uma redução de cerca de 50% no colagénio tipo III, enquanto que não foi detectado qualquer colagénio tipo III em animais mutantes homozigóticos (Fig. 1C).

os animais mutantes eram férteis, mas apenas os ratinhos heterozigóticos eram fenotipicamente normais. Ratos mutantes homozigóticos apresentaram uma taxa média de sobrevivência de 5% na idade de desmame, com a maioria das mortes ocorrendo dentro dos primeiros 48 horas após o nascimento (Tabela 1). A causa precisa da letalidade neonatal não é clara porque as crias mortas foram canibalizadas antes de poderem ser examinadas, e a análise histológica microscópica leve de recém-nascidos vivos mutantes homozigóticos não detectou qualquer anomalia grave. Os ratos mutantes adultos homozigóticos pareciam normais, excepto que eram cerca de 15% mais pequenos do que os seus companheiros de ninhada do mesmo sexo (dados não apresentados). A duração média de vida dos ratos mutantes homozigóticos foi, no entanto, de cerca de 6 meses ou um quinto da duração normal de vida. A autópsia mostrou que a ruptura dos vasos sanguíneos foi a principal causa da vida encurtada destes ratos (Tabela 2). Os locais de ruptura foram esporádicos e principalmente associados com grandes vasos sanguíneos. A análise histoquímica foi realizada para encontrar o defeito que causou a fragilidade da parede dos vasos sanguíneos. Figo. 2 A E B mostram uma secção transversal da aorta abdominal normal. A parede da aorta é composta por intima e mídia (Fig. 2A, arrow) e adventitia (Fig. 2 A E B, pontas de flechas). O meio consiste de fibras elásticas (Fig. 2B, setas grandes) e células musculares suaves(Fig. 2B, pequenas flechas) e fornece a elasticidade da aorta, enquanto a adventícia compreende principalmente fibrilhas de colágeno tipo I e limita a dilatação da aorta. Figo. O 2C mostra uma secção transversal de um aneurisma dissecante da aorta abdominal de um ratinho mutante homozigótico. A ruptura atravessou o meio (seta), o que levou a um canal cheio de sangue (estrela) entre o meio e adventícia (pontas de flecha) e parcialmente colapsou o lúmen da aorta. A adventícia eventualmente rompeu em outro lugar, e o sangue vazou na cavidade peritoneal como é o caso em humanos com aneurisma aórtico letal (20). O arranjo geral das fibras elásticas e das células musculares lisas (Fig. 2D) foi semelhante ao dos controlos (Fig. 2B). A intensidade e distribuição do material de matriz extracelular e a coloração mais escura na adventícia e entre fibras elásticas e células musculares lisas na intima de ratos mutantes (Fig. 2D) eram comparáveis aos controlos de tipo selvagem(Fig. 2B). Não se observaram defeitos óbvios de coração, medianização e pequenas artérias em animais mutantes ao microscópio luminoso (dados não apresentados).

para além do aneurisma, os ratinhos mutantes apresentaram aumento intestinal frequente e ruptura intestinal ocasional, resultando em morte (Tabela 2). Cerca de 60% dos ratos mutantes homozigóticos apresentaram lesões cutâneas, as mais graves das quais apresentaram uma ferida aberta de cerca de 1 cm de comprimento na área do ombro, que penetrou completamente a pele e o tecido subcutâneo exposto (Fig. 3). As feridas não foram devidas a lutas entre animais, uma vez que foram observadas em animais enjaulados separadamente. A análise microscópica ligeira da pele, intestino e outros órgãos internos, incluindo fígado e pulmão, não detectou qualquer anomalia evidente em animais mutantes (dados não apresentados).

para definir os defeitos estruturais em animais mutantes, foram realizadas análises microscópicas de elétrons da aorta e coração. Figo. 4 mostra que as fibrilhas de colagénio localizadas entre as células do músculo liso ou entre as células do músculo liso e as fibras elásticas (Fig. 4A, flechas) estavam ausentes ou severamente reduzidos no meio da aorta mutante (Fig. 4B, setas). Mais notavelmente, na adventícia onde a maioria do colágeno é tipo I, O diâmetro das fibrilhas do colágeno da aorta mutante foi altamente variável (compare Fig. 4 D A C). Quando as fibrilhas foram contadas e o diâmetro destas fibrilas medido numa dada área da adventícia, descobrimos que o número de fibrilas em mutantes foi reduzido para aproximadamente um terço do diâmetro do tipo selvagem, enquanto o diâmetro médio das fibrilas em mutantes foi aproximadamente o dobro do dos ratos selvagens (Fig. 5). Semelhante à aorta, as fibrilhas de colagénio entre o epicárdio e o miocárdio foram reduzidas ou omissas e os microvillos do epicárdio estavam subdesenvolvidos no coração dos ratinhos mutantes (dados não apresentados).

além do sistema cardiovascular, a pele, intestino, fígado e pulmão de ratos mutantes foram examinados por microscopia eletrônica. Tal como acontece com a adventícia da aorta, as fibrilhas do colagénio I na pele mutante (Fig. 4F, flechas e pontas de flecha) eram desorganizadas e eram muito variáveis em diâmetro em comparação com as de ratos selvagens (Fig. 4E, arrows). Esta alteração foi também observada no fígado e pulmão de ratinhos mutantes (dados não apresentados). Além disso, as fibrilhas de colagénio estavam ausentes ou muito reduzidas na submucosa e serosa dos intestinos mutantes (dados não apresentados), sugerindo que as fibrilhas de colagénio nestas áreas são, na sua maioria, fibrilhas de colagénio tipo III.Estudos anteriores que introduziram mutações específicas nos genes Col1a1, Col2a1, Col5a2 e Col9a1 trouxeram importantes percepções sobre a função destes colagénios (24-27). Aqui nós mostramos que o colágeno tipo III tem um papel crítico na fibrilogênese, que é uma parte importante do desenvolvimento de órgãos como o sistema cardiovascular, intestino e pele. A falta de colagénio tipo III perturbou a fibrilogénese e resultou num desenvolvimento defeituoso e numa falha funcional destes órgãos. Em condições fisiológicas, o colagénio de tipo III não é apenas um componente essencial das fibrilhas em tecidos como o meio da aorta, mas também um elemento regulador importante na fibrilogénese do colagénio de tipo I. Nossos resultados sugerem que o colágeno tipo III regula o diâmetro das fibrilhas do colágeno tipo I, que serve como um mecanismo para atender às necessidades fisiológicas de diferentes tecidos ou de um tecido em diferentes estágios de desenvolvimento. O fenótipo de ratinhos com deficiência em colagénio tipo III assemelha–se muito às manifestações clínicas de doentes com síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV em que a morte resulta de um vaso sanguíneo ou ruptura intestinal (20). Estes ratos mutantes devem, por conseguinte, revelar-se bons modelos animais para compreender esta doença e, possivelmente, para testar abordagens terapêuticas.