O que é o colony PCR?

Colony PCR is a rapid, high throughput PCR method to determine the presence or absence of the inserted DNA into plasmid directly from the bacterial colonies.

a clonagem Molecular é um dos métodos mais populares para a transformação do DNA desde muito tempo. No entanto, para determinar a presença ou ausência da inserção de ADN, temos de realizar experiências de transformação.

Colony PCR é um novo método no qual, ao projetar os iniciadores específicos de DNA inseridos, podemos identificar se nosso DNA de interesse é inserido no plasmídeo ou não.No entanto, não é tão simples como estamos a discutir.

neste artigo, vamos focar especialmente na PCR da Colônia, o princípio da PCR da Colônia, suas vantagens e limitações.

para isso, temos que entender vários termos e tópicos. Vamos começar o nosso tópico a partir do básico. O conteúdo do artigo é,

“um plasmídeo é o ADN circular bacteriano que se reproduz independentemente do cromossoma bacteriano e é usado na manipulação genética e transferência de genes.”

a clonagem genética é uma ferramenta genética molecular tradicional usada há muito tempo nos laboratórios. Brevemente, na clonagem genética, o gene do nosso interesse é inserido no plasmídeo por meios artificiais. Este ADN é replicado independentemente do cromossoma bacteriano.

plasmídeos são, na verdade, usados para gerar muitas cópias de curtos segmentos de DNA. Como as bactérias se replicam mais rápido do que qualquer outro organismo, podemos gerar muitas cópias do gene de nosso interesse inserindo-o no plasmídeo bacteriano.

f-plasmídeo, Col-plasmídeo, degradante – plasmídeo e plasmídeo de resistência são vários tipos comuns de plasmídeos encontrados em bactérias.

além disso, o plasmídeo pode funcionar como um portador molecular que transfere pequenos segmentos de ADN de uma célula para outra.

nós cobrimos um artigo incrível em profundidade sobre DNA plasmídeo. Leia aqui: DNA plasmídeo-Estrutura, Função, Isolamento e aplicações.

para além das bactérias, vários outros procariotas também contêm ADN plasmídeo. A principal função do plasmídeo nas bactérias é a sua sobrevivência nas condições adversas.

como o gene de transferência de plasmídeos de nosso interesse, é muito importante determinar se o nosso gene de interesse é inserido ou não no plasmídeo.

para isso, podemos usar vários métodos como a PCR e a cultura microbiana.

Platting the colonies take more time and the sensitivity of the method is also not good as well. A possibilidade da contaminação é sempre alta em métodos de cultura bacteriana.

portanto, os resultados não são precisos.A nossa PCR também ajuda aqui. Utilizando o método de PCR da Colónia, pode determinar-se ou identificar-se uma inserção de ADN.

1. How to set up a DNA extraction lab: A comprehensive guide (chemicals, instruments and other utilities).
2. deleção do cromossoma 6p: uma razão para não haver dor, fome e sono

o que é a PCR da Colónia?

a PCR de Colónia é a modificação da PCR convencional na qual as colónias bacterianas são directamente utilizadas como modelo PCR.

o ADN plasmídeo que contém o ADN do nosso interesse é amplificado nas condições cíclicas dependentes da temperatura.

a representação gráfica da PCR da Colónia é mostrada na figura abaixo,

princípio da PCR das Colónias:

a colónia bacteriana que contém o plasmídeo pode ser directamente amplificada utilizando dois conjuntos de iniciadores. Os iniciadores específicos de inserção que amplificam a sequência de inserção e os iniciadores de flanco específicos do vector, que amplificam o ADN plasmídeo que não o ADN inserido (regiões de flanco em ambos os lados da inserção).

usando a inserção de iniciadores flanqueados (que amplifica o resto do DNA) o tamanho da nossa inserção de DNA pode ser determinado.

uma colónia bacteriana é colhida e adicionada directamente ao mastermix contendo todos os reagentes PCR. Além disso, adicionando um passo inicial de aquecimento para a PCR, o DNA plasmídeo sai da célula bacteriana e amplificou na reação.

este é o princípio básico da PCR da colônia, no entanto, pode ser modificado dependendo dos Requisitos.

the protocol of colony PCR:

The colony PCR is one of the excellent modification of the conventional PCR. Em vez de ADN-modelo, as colónias bacterianas são directamente adicionadas à reacção. Além disso, Taq DNA polimerase, primers, PCR reaction buffer e DD/W são adicionados na reação PCR também.

aqui na colônia PCR, a seleção de iniciadores é muito importante. Além disso, a seleção de iniciadores depende do objetivo da nossa experiência.

que tipo de informação queremos da nossa experiência PCR da colónia?

1. 1. 1. informações apenas sobre a presença ou ausência da sequência inserida.
      2. informação sobre o tamanho da sequência inserida.
      3. informação sobre a orientação da sequência inserida.

dependendo de que diferentes iniciadores PCR são projetados para a PCR da colônia.

os iniciadores específicos de inserção ligam-se à localização específica em ambos os lados do ADN inserido de nosso interesse. Se ele é transferido corretamente para o plasmídeo, estes primers podem se ligar a ele caso contrário, ele não pode ser capaz de se ligar.

este conjunto de iniciadores fornece informações sobre a presença ou ausência da sequência inserida.

primers específicos à orientação são primers únicos nos quais um primer se liga dentro da sequência inserida e outro primer se liga à sequência de ADN plasmídeo (sequência que não o ADN inserido).

este tipo de conjunto primer fornece informações sobre a orientação do DNA inserido de nosso interesse. Se nosso DNA inserido não for devidamente ligado ao vetor, o primer específico a esse lado da seqüência não pode se ligar, e não teremos a amplificação.

os primários específicos de plasmídeos são também tão importantes como os primários específicos de orientação. Este conjunto de iniciadores são projetados a partir da região de flanco da inserção que se liga ao exterior do DNA de nosso interesse.

este conjunto de iniciador ajuda a determinar o tamanho da inserção. Expande regiões que não o ADN inserido.

A reacção de PCR para a realização de colônia de PCR é como se segue,

Componente	Concentração	> Quantidade
Master mix (Especiais para a Colônia de PCR)	1X	12µL
Reacção de PCR buffer Com 2mM de MgCl2*	1X	5 µl
Forward primer	10	1µL
Reverse primer	10	1µL
O sobrenadante		3µL
Água		3µL
Total	———	25µL

O procedimento de colônia de PCR em:

Bem, a colônia de PCR não precisa extraído DNA.Não estamos a extrair ADN aqui. Em vez disso, vários outros métodos são usados para aumentar a sensibilidade da reação.Está bem, porque não estamos a extrair ADN para o ADN plasmídeo?

porque a razão é simples, a membrana celular da célula bacteriana é muito lisa.

já tínhamos discutido a membrana celular da célula bacteriana. Leia aqui: diferentes tipos de métodos de extração de DNA

uma bactéria contém membrana de células moles que pode facilmente ser lisado por aquecimento ou centrifugação a alta velocidade.

também, não precisamos do próprio DNA bacteriano. O plasmídeo circular circulante está presente no citoplasma da bactéria, pelo que também não são necessários passos adicionais de purificação. Rompendo a membrana celular, nosso DNA modelo está pronto para a amplificação.

Ok, vamos rapidamente passar pelo método para obter um bom DNA plasmídeo.

com a ajuda do apanhador estéril, escolha várias colónias bacterianas e transfira-as para o tubo Eppendorf.

Agora adicione buffer TE nele e misture-o bem. Podes usar o D / W também.Aquecer a amostra no banho de água a ferver durante 20 minutos.

gentilmente vertê-la.

centrifugar a amostra a alta velocidade durante 2 minutos.

transferir o sobrenadante para outro tubo e utilizá-lo como um ADN-modelo.

adiciona-se uma amostra de 20 µl à reacção.

Informação adicional:

porquê sobrenadante e não sedativo?

o DNA é uma biomolécula de vida. O ADN plasmídeo é ainda menor do que o ADN nuclear bacteriano. Ele contém apenas vários genes de até 1000bp a 20.000 bp.

portanto, centrifugando-o apenas, o ADN plasmídeo mais leve sai da célula e instala-se no sobrenadante, enquanto o sedimento contém proteínas e ADN nuclear, pelo que não o estamos a usar.

agora chegando ao ponto.O nosso plasmídeo está pronto para amplificação.

in another method,

Use the bacterial colony directly.

this method is a combination of Hotstart PCR and colony PCR.

as colónias bacterianas são colhidas e adicionadas ao tubo de reacção PCR.

os tubos são colocados na máquina PCR. Adiciona-se um passo adicional de aquecimento.

aquecendo-o 5 a 7 minutos, o ADN plasmídeo sai da célula.

agora os iniciadores específicos da inserção amplificam o DNA que inserimos. E os suportes de flanco amplificam o resto do ADN.

a amplificação é feita por 20 a 25 ciclos. O ciclismo condições para a colônia de PCR está listada abaixo,

PCR Passos	Inicial de Desnaturação	Desnaturação	Recozimento	Extensão	Final de extensão
Temperatura	95 C	95 C	55-65 C	72 C	72 C
Tempo	3min	10 s	45 sec	50 sec	5 min
	——-	——-	25 ciclos	—–	——-

Leia o interessante artigo sobre PCR convencional: UM Guia Completo da Reação em Cadeia da Polimerase

Sugestões para melhoria:

Usar apenas algumas colônias, como muitas colônias aumentar a chance de não-específica ligações.

utilizar controlo positivo e contol negativo.

como um controle positivo usado o iniciador flanqueado, mesmo se a inserção não está presente, a reação PCR dá banda de DNA do DNA plasmídeo, o que indica que a reação que preparamos é correta.

como controlo negativo, utilize o plasmídeo Não transformado( plasmídeo sem inserção de ADN), este ADN plasmídeo só é amplificado se a inserção estiver presente.

como uma inserção usa sequências de DNA curtas, sequências de DNA mais longas aumentam a chance de ligações não específicas e falha de reação da PCR.

além disso, utilize programas PCR mais curtos.

a principal aplicação do PCR de Colónia é a identificação da ligação correcta e inserção de ADN inserido em bactérias, bem como plasmídeo de levedura.

após a conclusão da reacção de PCR em colónias, os produtos PCR são executados com o gel de agarose a 2%. Os resultados da experiência são apresentados na figura abaixo.,

observe agora cuidadosamente os resultados, O M é o marcador molecular de ADN de 3000bp. Suponha, o DNA de nosso interesse, “inserir” é um fragmento de 400bp que é inserido no plasmídeo.

ver a faixa 2: O fragmento de 400 bp da nossa inserção.

desenhámos iniciadores flanqueados a 100bp de ambos os lados da sequência. Se o iniciador flanqueador amplifica o DNA juntamente com a inserção o produto é de 600 bp, veja a faixa 3 (400 bp de inserção DNA + 200 bp região flanqueada).

Now, see lane 1, it is a positive control without the insert or a normal plasmid without the transformed DNA. Por isso, os primários de flanco só amplificam 200 bp de ADN.

ver lane 1, 200bp fragmento de ADN sem inserção (controlo positivo).

agora, observe a faixa 4. A pista 4 é o resultado dos iniciadores específicos de orientação. O iniciador específico de orientação é uma combinação de iniciador específico de inserção e iniciador específico de região flanqueada.

uma primer de inserção de DNA e uma primer da região de flanco específica primer são selecionados para a amplificação de primer específica de orientação.

portanto, 100 fragmentos de bp da região de flanco primer e 400bp da inserção DNA é amplificado e 500 BP fragmento de DNA é observado na faixa 4.

Lane 5 é o controle específico de inserção que dá 400 BP fragmento de DNA.

Lane 6 é o controle negativo sem o modelo. Através do controlo negativo, qualquer contaminação pode ser identificada. O tubo de reacção contém todos os ingredientes, excepto o modelo. Então, idealmente, não há bandas de DNA presentes nesta faixa.Se for observada uma banda de ADN, a amostra está contaminada.Vantagens da PCR de colónias:

• a técnica é rápida e rentável.
• além disso, a precisão e especificidade da técnica são mais elevadas.
• o conjunto é simples assim como a PCR convencional, extração de DNA e purificação de plasmídeos como etapas laboriosas não são necessárias.
• não é necessário restringir a digestão para a identificação do ADN inserido.
• toda a experiência pode ser concluída em 90 minutos.

desvantagens da PCR das Colónias:

• o método é rentável, rápido e confiável, no entanto, qualquer mutação na sequência não pode ser detectada.
• além disso, a informação da sequência não pode ser obtida pela PCR da colónia. temos de sequenciar a confirmação da transformação do ADN.
• a probabilidade de resultados falsos positivos é elevada.

leia mais;O que é uma PCR multiplex?

após a conclusão do experimento, a amostra é enviada para a sequenciação onde a sequência de DNA de nosso interesse pode ser determinada.

podemos até fazer PCR multiplex, combinando ambos insert primers específicos e plasmídeos específicos.

Conclusion:

Although the colony PCR is the best choice for the identification of gene transfer, the only colony PCR technique is not sufficient to interpret the results. É possível que algumas das mutações presentes na inserção, que não podem ser detectadas pela PCR.

para confirmar os resultados é necessário sequenciamento do ADN. Depois de determinar a ordem de sequência podemos dizer se nosso gene de interesse é inserido corretamente ou não.