o Refino do filo Chlorobi resolvendo o filogenia e potencial metabólico do representante do profundamente ramos, cultivar linhagem
Genômica reconstrução de NICIL-2
comunidade Microbiana, a análise da composição de thermophilic bacteriana consórcios adaptada para crescer em biomassa substratos (celulose, xylan e switchgrass) como sua única fonte de carbono em 60 °C consistentemente identificados onipresente OTU97 foi distantemente relacionado com membros Cultos do filo Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). A sequenciação metagenômica de um consórcio adaptado para crescer em switchgrass iônicos-líquidos pré-tratados, em que o OTU97 relacionado com Clorobi era abundante, foi realizada para entender o potencial filogenia e metabólico da população que foi representado por este OTU97. Montagem (ver materiais e métodos) e binning automatizado (Wu et al., 2014) do metagenoma deste consórcio rendeu 20 latas genômicas (tabela suplementar S3), entre as quais as latas mais abundantes eram uma população intimamente relacionada com a estirpe NYFB Chitinophagaceae (61,8%), que foi isolada de um enriquecimento relacionado cultivado em celulose (eichorst et al., 2013), e o bin relacionado com Clorobi (23,1%). Bandejas presente em >1% incluíram vários aculturados populações de clustering com o Paenibacillaceae (baldes 003 e 006), uma cultivar população de cluster com o Verrucomicrobia subdivisão 3 (bin 004) e uma população intimamente relacionado com o Thermobipora bispora (bin 005), um actinobacterial thermophile.
o bin relacionado com Clorobi foi nomeado NICIL-2 (para composto iónico líquido de Newby Island-2 em abundância). A análise das proteínas previstas a partir do genoma NICIL-2 foi consistente com a sua identificação como uma população distantemente relacionada com os membros do superfilo FCB, com os Bacteroidetes (33%) e Ignavibacteria (15,7%) tendo as sequências proteicas mais estreitamente relacionadas (Figura 1). O rascunho do genoma NICIL-2 recuperado foi relativamente pequeno (2,67 Mbps) e quase completo (95,3%; 102 dos 107 genes marcadores de cópia única em 152 Andaimes). O comprimento N50 para o genoma NICIL-2 foi 168 929 bp e o maior contig foi 1.1 MB, sugerindo que a maioria dos andaimes representava um conjunto de alta qualidade (Quadro 1).
a distribuição da melhor linhagem para todas as proteínas NICIL-2. As percentagens são estimadas dividindo as contagens de proteínas que correspondem a cada linhagem contra o número de todas as proteínas NICIL-2. Veja materiais e métodos para mais detalhes.
análise Filogenética de NICIL-2
UM gene 16S rRNA (1451 bp) foi recuperado o NICIL-2 projeto genoma. O ribótipo mais relacionado com o gene rRNA 16S de NICIL-2 (>99% idêntico) foi sequenciado a partir de um clone fosmid (JFF029_06) recuperado de uma corrente térmica (70 °C) em uma sequência japonesa de Mina De Ouro (Nunoura et al., 2005). 16S os genes rRNA de representantes cultos dos Bacteroidetes e Clorobi eram < 85% idênticos à sequência NICIL-2. Uma árvore filogenética construída alinhando sequências de genes 16S rRNA relacionadas com NICIL-2 demonstrou que a linhagem contendo NICIL-2 era distinta dos Bacteroidetes e Clorobi (Figura 2). A linhagem NICIL-2 continha duas linhas de descida com base na temperatura do ambiente de amostragem. O cluster de alta temperatura (representado em vermelho na Figura 2) incluiu ribotipos recuperados principalmente de ambientes de alta temperatura variando de 55 °C a 80 °C, como o clone OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). O segundo grupo incluía ribótipos recuperados principalmente de ambientes de temperatura moderada que variavam entre 20 ° C e 32 °C (representados em verde na Figura 2). Uma vez que OPB56 foi o primeiro clone descoberto que é afiliado a este aglomerado filogenético, a linhagem contendo NICIL-2 é referida como o clado OPB56. Uma visão expandida da árvore genética rRNA 16S é representada na figura suplementar S1.
A máxima probabilidade árvore filogenética construída para o romance linhagem NICIL-2 usando o ribossomal 16S do RNA do gene. O clado mais próximo da espécie NICIL-2 era de um fosmida isolado de uma mina de ouro Japonesa (Nunoura et al., 2005). As variações de temperatura das espécies foram determinadas a partir da literatura associada a cada número de adesão do NCBI. A temperatura interna das espécies foi marcada pelo vermelho (> 55 ° C), Verde (20-32 °C) ou negro (indeterminado). A barra de escala indica 0,05 alterações por local de nucleótidos. Os detalhes da construção de árvores são fornecidos em materiais e métodos. A árvore filogenética expandida mostrando todos os nós pode ser encontrada na figura suplementar S1. Uma versão a cores desta figura está disponível no ISME Journal online.
para estabelecer a afiliação filogenética de NICIL-2 e o clado OPB56 mais completamente, sequências adicionais de proteínas ribossômicas foram obtidas a partir de dados recuperados de amostras naturais. Homólogos de 22 genes ribossômicos conservados em NICIL-2 foram encontrados em dois clones fosmídicos de primavera térmica japoneses (JFF029_C06 e JFF027_B02). Este conjunto de 22 proteínas ribossômicas foi usado para pesquisar conjuntos de dados metagenômicos de ambientes de alta temperatura. Conjuntos completos destes genes ribossômicos conservados foram identificados em quatro conjuntos de dados metagenômicos obtidos a partir de ambientes de alta temperatura. O binning automatizado destes conjuntos de dados recuperou seis genomas quase completos (> 90% completos) que continham sequências para as 22 proteínas ribossomais conservadas no genoma NICIL-2 e para os clones fosmid da Mina De Ouro Japonesa (tabela suplementar S4). Cinco das seis sequências de proteínas concatenadas agrupadas na linhagem OPB56 com NICIL-2, enquanto uma das sequências da fada de Yellowstone se agrupa com a Ignavibacteria (figura 3a). Esta árvore filogenética demonstrou que a Clorobea, Ignavibacteria e OPB56 formaram um clado monofilético com alta confiança (97%). Os Bacteroidetes formaram um cluster distinto, e a família Rhodothermaceae, cuja afiliação com os Bacteroidetes foi questionada (Nolan et al., 2009), foram filiados com os Bacteroidetes com alta confiança (>80%). Uma segunda árvore filogenética foi construída concatenando um alinhamento de 86 genes de cópia única compartilhados entre Bacteroidetes, Clorobi e Fibrobacter (figura 3b). Esta árvore reproduzia a topologia observada para o gene construído a partir dos 22 genes ribossômicos, suportando ainda mais a afiliação dos Chlorobea, Ignavibacteria e OPB56.
A máxima probabilidade árvore filogenética construída para o romance linhagem NICIL-2 usando (a) 22 proteínas ribossômicas e (b) 86 de cópia única de proteínas compartilhada entre Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, OPB56 e Fibrobacter clusters. A barra de escala indica 0,1 alterações por local de aminoácidos. Os detalhes da construção de árvores são fornecidos em materiais e métodos.
A complementary approach to understanding evolutionary relationships between Bacteriodetes and Chlorobi has been to identify indels in conserved proteins (Gupta and Lorenzini, 2007). Insertions in DNA polymerase III (28 aa) and alanyl-tRNA synthetase (12-14 aa) that are conserved among the GSB and absent among the Bacteriodetes were attributed as characteristic of the phylum Chlorobi. Alinhamentos destas duas proteínas (Números Suplementares S2 e S3) indicam que a DNA polimerase III inserção no OGE de sequências de proteínas não está presente no previsto proteínas da Ignavibacteriae e NICIL-2 genomas, enquanto 2-3 aminoácidos da inserção no OGE alanil-tRNA sintetase sequências são conservados no Ignavibacteria e NICIL-2 de seqüências de proteínas.
Metabólica reconstrução de NICIL-2
fisiologia do NICIL-2 foi inferida por metabólica reconstrução e o seu potencial metabólico comparado com representantes do OGE (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus e Salinbacter ruber) e Ignavibacteria (Ignavibacterium álbum e Meliobacter roseus). Genes que codificam proteínas relacionadas com a fotossíntese, incluindo homólogos de C. tepidum da reação fotossintética centro de subunidades (CT1020, pscB, psC, pscD), chlorosome proteínas do envelope (csmABCDEFHIJX), e bacteriochlorophyll um proteínas (fmoA), estão ausentes em todos os outros genomas, distinguindo o OGE neste comparativo set (Eisen et al., 2002). A Figura 4 apresenta um resumo visual da reconstrução metabólica. Para informações genéticas completas, números de caixa e abreviaturas, ver quadros suplementares S5 e S6.
O metabolismo reconstruído de NICIL-2 inferido do genoma remontado. Para informações genéticas completas, números de caixa e abreviaturas, ver quadros suplementares S5 e S6. O texto vermelho representa enzimas ou vias biossintéticas que faltam no genoma. As setas azuis, verdes e roxas indicam o fluxo ATP, NADH e NADPH, respectivamente.
metabolismo do carbono
o genoma NICIL-2 codifica um conjunto completo de genes para a glicólise, o ciclo TCA e a gluconeogénese (Figura 4). Os Genes do ciclo rTCA, presentes e expressos para fixação autotrófica de carbono na GSB, estão ausentes. Além disso, a presença de genes que codificam cofactores contendo ácido lipóico na piruvato desidrogenase e complexos de α-cetoglutarato desidrogenase sugere que o ciclo TCA funciona na direção oxidativa. A maior parte do ciclo rTCA foi reconstruída em R. marinus e I. album, including multiple pyruvate-ferredoxin oxidoredutases and α-ketoglutarate-ferredoxin oxidoredductases, two required enzymes for the rTCA cycle. O I. album e R. marinus genomes não possuem citrato lyase dependente do ATP, uma enzima crítica para completar o ciclo rTCA (Buchanan e Arnon, 1990). Foi proposto que I. álbum pode usar um citrato lyase independente ATP para funcionar no ciclo rTCA em vez disso, embora esta alegação não é testada experimentalmente e nem I. álbum nem R. marinus tem sido mostrado para crescer autotrophicamente (Liu et al., 2012a).Apesar da sua elevada abundância relativa em culturas adaptadas que crescem em biomassa vegetal, o NICIL-2 tinha uma capacidade enzimática surpreendentemente limitada para desconstruir biomassa complexa. A comparação do potencial metabólico da hidrólise de polissacáridos entre as 20 Binas extraídas do metagenoma do enriquecimento pré-tratado com switchgrass demonstrou que o NICIL-2 tem relativamente menos genes para a desconstrução da celulose e da hemicelulose do que outros membros da comunidade microbiana (figura complementar S4). Em particular, a estirpe NYFB, a população verrucomicrobial e múltiplos Firmicutes Gram-positivos têm resistências mais extensas de genes para hidrólise de polissacáridos. A inspeção adicional dos genomas reconstrutados ligados à OPB56 a partir de amostras naturais de alta temperatura demonstrou que a falta de genes para a hidrólise de polissacáridos era comum a este clado. Entre os genomas que se agrupam com os Bacteroidetes e Clorobi, R. marinus, M. roseus e Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, que se agrupa com a Ignavibacteria, possuíam um extenso repertório de hidrolases glicosídeas para desconstruir biomassa vegetal. Estas análises sugerem que o NICIL-2 e os membros relacionados do clado OPB56 não estão provavelmente envolvidos na desconstrução primária da biomassa nos ambientes comunitários e naturais adaptados. É concebível que o NICIL-2 possa crescer com monômeros ou oligômeros de açúcar; no entanto, apenas um gene de transporte dissacarídeo previsto foi identificado no genoma.
embora a selecção para NICIL-2 tenha ocorrido em condições aeróbias, pode possuir a capacidade de fermentação. Os Genes para a produção fermentativa de etanol estão presentes (através da álcool desidrogenase, EC 1.1.1.1), enquanto os genes para formiato (via piruvato de formiato de liase, CE 2.3.1.54), lactato (via lactato desidrogenase, CE 1.1.1.27) e propionato (via methylmalonyl-CoA carboxilo transferase, 2.1.3.1) estão ausentes. O genoma NICIL-2 codifica um gene para a fosfotransacetilase (EC 2.3.1.8), mas não para a Acetato cinase (EC 2.7.2.1), sendo ambos necessários para a produção de acetato fermentativo. Tanto I. album quanto M. roseus contêm genes para a produção de lactato e acetato, enquanto C. tepidum não.No genoma NICIL-2 foram detectados Genes
metabolismo do azoto e do enxofre
para assimilação do amónio, glutamina sintase (EC 6.3.1.2) e glutamato sintase (EC 1.4.1.13). No entanto, não foram identificados genes para a redução dissimilatória de nitratos, redução assimilatória de nitratos, desnitrificação, fixação de azoto e nitrificação. C. tepidum codifica os genes nif necessários para a fixação do N2, enquanto M. roseus (Kadnikov et al.(2013), I. album (Liu et al., 2012a) e R. marinus (Nolan et al., 2009) do not. C. tepidum é um oxidante de enxofre obrigatório e, portanto, pode oxidar sulfeto, tiossulfato, sulfito e enxofre elementar. C. tepidum oxida preferencialmente sulfeto a enxofre elementar, então enxofre elementar e tiossulfato a Sulfato (Chan et al., 2008). Adicionalmente, sulfito pode ser oxidado quando fornecido no meio de crescimento, mas não pode sustentar C. tepidum como o único doador de elétrons (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus and R. marinus não tem todos os genes necessários para a oxidação de compostos de enxofre reduzidos.
biossíntese de aminoácidos
o genoma de NICIL-2 está faltando muitos genes-chave para a biossíntese de aminoácidos. As vias completas são codificadas para a alanina, arginina, asparagina, aspartato, β-alanina, glutamato, glicina, lisina e metionina. O NICIL-2 carece de ilvC e leuABCD e, por conseguinte, possui vias incompletas para a biossíntese da valina, da leucina e da isoleucina. Da mesma forma, o I. o genoma do álbum carecia de todos os genes necessários para a biossíntese da Valina, Leucina e isoleucina do piruvato, exceto para a amino transferase de cadeia ramificada (ilvE), enquanto M. roseus e C. tepidum contêm vias completas. Nem NICIL-2 nem I. album codifica genes necessários para a biossíntese prolina do glutamato (proBAC), enquanto tanto C. tepidum quanto M. roseus fazem. O gene sérvio para a biossíntese da serina está ausente em NICIL-2, I. album, M. roseus, e é encontrado em alguns GSB, incluindo C. tepidum. O NICIL-2 também pode utilizar aminoácidos como substratos de crescimento. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).
Electron transport
The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). Em vez disso, a maioria dos genes estão organizados de forma independente ao longo da maior NICIL-2 torre (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE e nuoMN), e os restantes genes são encontrados em três menores de andaimes (nuoAB, nuoL e nuoC), indicando que a ausência de um operon estrutura não é um artefato de montagem. C. tepidum contém um conjunto de genes codificados para a NADH: ubiquinona oxidoredutase que carece de nuoEFG (11 subunidades). I. album e M. roseus contêm dois conjuntos de nuoABCDHIJKLMN e um conjunto de nuoEFG cada (figura suplementar S6). Curiosamente, o complexo I de NICIL-2 está mais intimamente relacionado com os de Rhodothermus marinus e Salinibacter ruber dos Bacteroidetes, ambos contendo um conjunto completo de genes para NADH:ubiquinona oxidoredutase (figura 5a). Homólogos para as 11 subunidades complexas I também foram identificados em todas as seis células relacionadas com NICIL – 2 recuperadas de Yellowstone e grande mola de ebulição, e um conjunto concatenado dessas sequências de proteínas agrupadas com as sequências de NICIL-2.
vizinho unindo-se às proteaginosas não enraizadas do complexo I (A) e do complexo III (b) alternativo. Números entre parênteses denotam o número de subunidades usadas para construir a árvore. Barra de escala indica x alterações por local de aminoácidos.
O ACIII é uma nova classe de membrana bacteriana oxidorredutases encontradas em organismos que muitas vezes não possuem o complexo bc1 (Yanyushin et al., 2005). The ACIII from R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) and filamentous anoxygenic phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) foi purificada e estudada. Recentemente, grandes números de clusters de genes codificando para subunidades ACIII, com variações na Constituição e organização, foram encontrados em uma gama de genomas bacterianos (Refojo et al., 2013). Por exemplo, R. marinus contém os genes actABCDEF em um operon que codifica seis ACIII subunidades; homologs deste gene cluster tem sido identificado em vários membros da Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Uma árvore filogenética retrata a relação de ACIII de NICIL-2 a seus parentes mais próximos (figura 5b). O GSB não possui ACIII e, portanto, não estão representados nesta árvore. No entanto, ” Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, que não é um membro do GSB, codifica um ACIII que provavelmente funciona na respiração aeróbica (Liu et al., 2012b). É importante notar que tanto I. album como M. roseus são únicos entre este conjunto de ACIII como eles contêm cinco subunidades, com as subunidades actDE identificadas como uma proteína de fusão. Um complemento completo de genes codificando para todas as subunidades ACIII, que foram recuperados de duas células genômicas relacionadas com o NICIL-2 dos metagenomas de Yellowstone, foram encontrados para conter a fusão actDE e agrupados com I. album e M. roseus. O NICIL-2 não contém esta fusão e os genes do seu complexo ACIII estão mais estreitamente relacionados com R. marinus e S. ruber.
NICIL – 2 aceitadores terminais de electrões incluem uma citocromo C oxidase tipo-aa3 (complexo IV) e possíveis alternativas citocromo c oxidases, anotados como CoxMOP. É pouco provável que o NICIL-2 seja microaerofílico, uma vez que as oxidases do tipo cbb3 não foram detectadas no genoma. Adicionalmente, o citocromo bd não foi detectado. Para comparação, tanto os genomas I. album e M. roseus contêm genes para citocromo C oxidase tipo cbb3 e um complexo citocromo bd.
o genoma NICIL-2 contém um conjunto incompleto de genes do homem para a síntese da menaquinona. Uma via biossintética completa de menaquinona contém menFDHCEBAG (Bentley e Meganathan, 1982) e o genoma NICIL-2 apenas inclui menBAG. Para comparação, C. tepidum e I. o álbum contém caminhos completos para os homens, enquanto os genomas M. roseus e R. marinus têm anotações para todos os genes necessários, exceto menB e menH, respectivamente. Homólogos de genes que codificam enzimas da via biossintética alternativa menaquinona, a via futalosina (Arakawa et al., 2011), não foram detectados em NICIL-2. Os genes biossintéticos da ubiquinona também estão ausentes. O genoma NICIL-2 pode ter uma cobertura incompleta nesta área e genes humanos adicionais podem ser encontrados com um genoma completamente montado. Em alternativa, o NICIL-2 pode trocar quinonas com outros membros da comunidade, como observado para o consórcio fototrófico “Chlorochromatium aggregatum” (Liu et al., 2013).
Flagella and chemotaxis
Genes que codificam proteínas para o corpo basal, gancho e conjunto de filamentos estão presentes no genoma NICIL-2. No entanto, NICIL-2 não possui genes codificando maquinaria de quimiotaxia, além de uma proteína regulatória, CheY. O GSB é considerado Não-móvel e falta de quimiotaxis e flagella, enquanto I. album, M. roseus e R. marinus têm maquinário flagelar e quimiotaxis.
