pintura de cromossomas
8 Territórios cromossómicos
em vez de serem dispersos pelo Núcleo, cada cromossoma ocupa um volume distinto, chamado de território cromossómico. Isso foi demonstrado pela pintura cromossômica—uma técnica baseada em peixes onde o genoma é hibridizado a um grande número de sondas específicas de cromossomos para permitir a visualização de cromossomos individuais dentro do núcleo. O posicionamento radial de um cromossoma é fortemente influenciado pela sua composição—cromossomas pobres em genes tendem a ocupar posições mais próximas da periferia nuclear, enquanto cromossomas ricos em genes são mais frequentemente localizados em direção ao interior . Esta tendência é ilustrada pelos cromossomos humanos 18 e 19, que são muito semelhantes em tamanho, mas têm uma composição de sequência muito diferente: o cromossomo 18 é pobre em genes, enquanto 19 é rico em genes. O laboratório Bickmore usou peixes do território cromossomo para investigar as posições dos dois cromossomos no núcleo e descobriu que o cromossomo 18 Estava consistentemente localizado mais perto da periferia nuclear do que o cromossomo 19 nas linhas celulares linfoblastos e fibroblastos . O posicionamento radial dos cromossomas no núcleo também foi encontrado para ser específico do tecido, com tipos de células mais intimamente relacionados exibindo um posicionamento cromossômico mais semelhante . O genoma humano também contém cinco cromossomas acrocêntricos, contendo sequências de ADN-cromossomas 13, 14, 15, 21 e 22 que são geralmente agrupados em torno do nucleolo—o local de transcrição e processamento do ARN ribossómico.
a regra radial do posicionamento cromossómico também influencia o posicionamento de segmentos alternados ricos em genes e pobres em genes dentro dos cromossomas-neste caso, os segmentos ricos em genes estão localizados mais centralmente, enquanto as regiões pobres em genes ocupam regiões mais próximas da periferia. Além disso, nos territórios cromossómicos, os segmentos transcripcionalmente inactivos estão localizados internamente e os segmentos transcripcionalmente activos estão à superfície do território . Este arranjo permite que regiões transcritivamente ativas tenham acesso a máquinas e domínios de transcrição ricos em fatores metabólicos do ARNm, tais como SC-35 foci . No entanto, a estrutura de pormenor dos territórios cromossómicos ainda não é clara, reflectindo a nossa falta de conhecimento das estruturas cromatínicas que os moldam.
do ponto de vista da estabilidade do genoma, uma importante consequência dos padrões de posicionamento cromossómico está relacionada com as translocações, a anomalia cromossómica mais frequente observada na população humana. É bem estabelecido que a proximidade física de dois cromossomos no núcleo afeta a probabilidade de uma translocação ocorrer entre eles (Fig. 23.3).
Figura 23.3. As posições preferidas dos cromossomas no núcleo influenciam a frequência de translocação.
cromossomas com a mesma posição radial preferida no núcleo (por exemplo, cromossomas 17 e 19) são mais susceptíveis de estar envolvidos em translocações do que cromossomas com diferentes posições radiais (por exemplo, cromossomas 17 e 18).
Uma análise entre as freqüências diferentes não patogênicas translocações da população humana e o preferido radial posições de cromossomos no núcleo encontrado que os cromossomas com semelhante nuclear posições formulário translocationsmore frequentemente do que o esperado pelo acaso . Outro estudo foi capaz de demonstrar a proximidade entre o BCR e ABL loci, envolvido na translocação T bem caracterizada(9; 22) formando um cromossomo “Filadélfia” em leucemia mielóide crônica. Os autores mostraram que o BCR e o loci ABL estavam mais próximos nos linfócitos B do que nas células progenitoras hematopoiéticas, sugerindo que os aspectos específicos do tipo de célula da organização nuclear podem contribuir para a associação de certas translocações com tipos específicos de câncer. Em 2013, o Misteli lab publicou um estudo explorando a dinâmica de quebras de dupla cadeia e subsequente formação de translocação em um sistema elegante: as células NIH3T3duo codificam um pequeno número de locais de restrição enzimática SceI integrados em diferentes cromossomos, com alguns locais adjacentes a uma matriz LacO e outros locais vizinhos a uma matriz de TetO. Após indução de ruptura pela enzima SceI, foi possível rastrear as fracturas marcadas por Lac (LacR) com fluorescência e proteínas afastadoras Tet (TetR).; a formação de translocação foi indicada pela co-localização estável e duradoura dos sinais LacR e TetR. Os autores foram capazes de demonstrar que a maioria das translocações são formadas por loci que estão intimamente localizado antes da quebra de indução (contacte-primeiro modelo), e não como resultado de um movimento de double-strand breaks proximal locais (quebra-primeiro modelo).
para além dos métodos de análise dos territórios cromossómicos, dois métodos complementares principais são utilizados para estudar a organização 3D do genoma ao nível da estrutura de domínio de ordem superior: Métodos baseados em peixes e métodos de captura de confirmação de cromossomas . FISH baseia-se na hibridação de sondas marcadas fluorescentemente para visualizar loci individual, partes definidas do genoma ou cromossomas inteiros. Fornece um instantâneo da estrutura nuclear ao nível de uma única célula, mas as desvantagens são que ela é demorado e fornece uma quantidade limitada de informações a uma baixa resolução. As técnicas de captura de conformação cromatina (3C) dependem da “congelação” da estrutura nuclear por interações cruzadas dentro do núcleo, ligando fragmentos de DNA mantidos na proximidade pelas ligações cruzadas, seguido por PCR ou sequenciação de próxima geração para identificar fragmentos de DNA híbrido, indicativo de contatos. Na extremidade mais sofisticada, estas técnicas podem identificar teoricamente todas as interações possíveis em todo o genoma, mas há também desvantagens. Ao contrário do FISH, as técnicas 3C trabalham em populações de células em vez de num único nível celular, produzindo uma média populacional que pode reflectir uma série de configurações de contacto diferentes ao nível de uma única célula. Apesar das ressalvas, metodologias 3C têm sido muito influentes no campo da organização do genoma 3D, contribuindo com o conceito de associação topológica domínios (TADs). Os TADs são definidos como regiões com ∼900 kb, onde os mapas de contato mostram o aumento das interações.; Estudos baseados em peixes mostraram que as sondas localizadas dentro de um DAT são fisicamente mais próximas do que as sondas não localizadas dentro do mesmo dat, mas separadas por uma distância genômica “linear” semelhante . O genoma humano completo é dividido em aproximadamente 2000 TADs que também se sobrepõem com a distribuição de marcas de histona e outras características genômicas, tais como o tempo de replicação (descrito mais tarde). No entanto, eles não são específicos do tipo celular e a questão do nível de organização estrutural que eles refletem e sua importância funcional ainda está aberta ao debate. Curiosamente, a translocação de frequência padrão observado com cromossomo territórios também podem ser rastreados para o TAD nível de organização—um estudo realizado em células B descobriram que a probabilidade de translocação entre dois loci está fortemente relacionado com o contato de frequência entre eles, conforme definido pelo cromossomo confirmação de captura gerado pelo contato mapas .
