Interpretação quantitativa dos testes de ADN de citomegalovírus: compreender a perspectiva laboratorial | Jiotower
características analíticas dos testes
existem características de desempenho dos testes de carga viral que devem ser entendidos a fim de utilizar adequadamente e interpretar os resultados dos testes. Estes incluem o limite de detecção( LOD), LOQ inferior e superior, alcance linear, precisão (reprodutibilidade) e precisão. O LOD, definido como a menor concentração de ADN que pode ser detectada em 95% das réplicas, é normalmente utilizado para testes moleculares qualitativos.; no entanto, o termo também pode ser aplicado a testes quantitativos de carga viral. Os loq superiores e inferiores são as concentrações mais elevadas e mais baixas de ADN que podem ser quantificadas com “precisão aceitável” . Atualmente, não existe uma definição acordada para” precisão aceitável”; portanto, laboratórios individuais definem isso localmente. A forma como a” precisão aceitável ” é definida pode influenciar grandemente o LOQ. O LOD pode ser equivalente ao LOQ inferior ou inferior ao LOQ inferior. Nesta última situação, o teste pode detectar ADN CMV, mas o valor não pode ser quantificado com precisão. Nestes casos, o laboratório poderia relatar o resultado como “detectado mas abaixo do LOQ”; alguns laboratórios relatam isso como “baixo positivo”.”O laboratório deve ser capaz de fornecer o LOD e LOQ; por exemplo, em nosso laboratório, o LOD do CMV teste de carga viral é de 100 cópias/mL, enquanto o LOQ é de 300 cópias/mL. Após consulta aos clínicos, foi tomada a decisão de comunicar valores de 100-300 cópias/mL como resultados “Baixos positivos”, enquanto que os valores >300 cópias/mL são reportados como um valor inteiro.
embora os testes moleculares muito sensíveis sejam frequentemente importantes para a detecção de agentes patogénicos infecciosos, este pode não ser o caso dos testes de ADN CMV. O significado clínico de níveis baixos de ADN CMV (<100-500 cópias/mL) pode ser difícil de interpretar, particularmente se forem testadas amostras de sangue total, porque níveis baixos de ADN CMV no sangue total ou no plasma nem sempre estão correlacionados com o desenvolvimento da doença. Alguns estudos foram feitos para determinar o limiar para o tratamento, incluindo um estudo de História natural da doença CMV em receptores de transplante de fígado . Utilizando o teste COBAS Amplicor Monitor (Roche Molecular Diagnostics), os autores mostraram que um valor de carga viral de 2000-5000 cópias/mL correlacionou-se com o desenvolvimento da doença de órgãos finais. Este valor de corte é dependente do teste e pode ser maior ou menor para outros LDTs. Os estudos demonstraram também que tanto o valor da carga viral como a taxa de alteração da carga viral são indicadores importantes do desenvolvimento da doença activa . Quanto mais rápida for a taxa de aumento do valor da carga viral, maior será o risco de desenvolver a doença CMV. Uma vez que os testes sejam recalibrados com a norma internacional, pode ser identificado um LD universal clinicamente relevante e LOQ inferior. Com base nos dados e experiência actualmente disponíveis, 250-500 UI/mL podem ser um LOD apropriado e/ou LOQ inferior.
Dado que a maioria dos LDTs em tempo real, reação em cadeia da polimerase tecnologias, o intervalo linear do CMV exames de carga viral é geralmente em menos de 6 log10; por exemplo, o teste pode detectar a partir de 2.0 log10 cópias/mL (100 cópias/mL) para 7.0 log10 cópias/mL (10 milhões de cópias/mL). Uma revisão dos testes de carga viral CMV realizados em 2009 nos Laboratórios Médicos de Emory mostrou que dos testes de carga viral de ADN de aproximadamente 8500 CMV realizados em amostras de plasma, 671 (7, 9%) foram positivos. Destes, 394 (58,7%) foram <1000 cópias/mL, 169 (25.2%) tinham entre 1000 e 10 000 cópias/mL, e 63 (9.4%) tinham entre 10 000 e 100 000 cópias/mL. Além disso, 45 (6, 7%) tinham uma carga viral de ADN CMV >100 000 cópias/mL. Embora sejam comuns baixos valores de carga viral, o seu significado clínico não é claro. Valores de carga viral muito elevados são pouco frequentes e, quando ocorrem, são geralmente observados em doentes imunossuprimidos com infecção primária por CMV ou em doentes com doença muito grave. Uma vez que em alguns indivíduos podem estar presentes valores de carga viral até 10 milhões, o limite superior de quantificação de um teste deve estar nesta gama.
a interpretação de diferenças importantes nos valores longitudinais da carga viral num doente individual requer uma compreensão da precisão ou reprodutibilidade do teste. Tipicamente, a variabilidade dos testes de carga viral é maior perto do LOQ inferior e superior e menor no intervalo médio do ensaio. Como resultado, pequenas alterações nos valores baixos da carga viral não são significativas; por exemplo, não existe uma diferença clara entre os resultados num doente em que o valor da carga viral aumentou de 200 cópias/mL para 500 cópias/mL porque esta diferença está dentro da variabilidade do ensaio. Os dados mais úteis relativos a alterações clinicamente importantes nos valores da carga viral provêm da experiência com o VIH-1. Para estes aprovados pela FDA testes, a variabilidade do teste varia de 0,1 log10 cópias/mL 0,2 log10 cópias/mL, em comparação com a variabilidade biológica observadas na infecção crônica indivíduos não tratados, o que é cerca de 0,3 log10 cópias/mL. Assim, pensa-se que as alterações na carga viral de >0, 5 log10 cópias/mL representam alterações biologicamente importantes na replicação viral. Embora o valor de 0, 5-log10 cópias/mL tenha sido amplamente adotado para uso com muitos outros agentes patogénicos virais, pode não ser preciso para CMV. Uma vez que a variação biológica da CMV não é conhecida, as alterações importantes nos valores da carga viral têm sido avaliadas historicamente apenas com base na variabilidade do teste. O trabalho adicional com o VIH-1 mostrou que a DP do teste precisava ser ≤0, 15 log10 cópias/mL para discernir alterações 5 vezes nos valores da carga viral . Para CMV LDTs, espera-se que a variabilidade do ensaio não seja melhor do que a observada nos testes de carga viral VIH-1 aprovados pela FDA e que possa ser mais elevada, particularmente perto do LOQ inferior . Portanto, ao detectar valores de carga viral CMV <1000 cópias/mL, alterações <5 vezes (0.7 log10) raramente reflectirão alterações clinicamente importantes na replicação viral. Para valores > 1000 cópias / mL, alterações 3 vezes (0, 5 log10) na carga viral podem ser significativas, embora possam diferir entre LDTs. Alguns centros relatam cargas virais como cópias / mL e como log10 cópias/mL porque os clínicos podem ser menos propensos a sobrepor pequenas alterações nos valores da carga viral quando expressos como valores log10.
deve ser colhida uma amostra inicial para o teste da carga viral no dia em que se inicia o tratamento com CMV, mesmo que o teste da carga viral com CMV tenha sido realizado alguns dias antes. Em doentes com doença não tratada podem ocorrer aumentos rápidos nas cargas virais CMV durante alguns dias, o que torna importante ter o valor da carga viral CMV no momento do tratamento. Se os valores da carga viral excederem o LOQ superior, recomenda-se que o laboratório dilua a amostra para determinar o valor real da carga viral. Uma vez iniciada a terapêutica, o intervalo ideal para monitorização é semanal porque a semi-vida do ADN CMV no plasma é de 3-8 dias . Outra razão para o uso deste intervalo é que não é raro que a carga viral do ADN CMV aumente num doente alguns dias após o início da terapêutica, o que pode ser mal interpretado como falência do tratamento. Uma vez que os doentes com ADN persistente no plasma ou no sangue total têm um risco aumentado de recidiva , as orientações actuais recomendam a continuação da terapêutica antivírica até os valores da carga viral não serem detectáveis. Alguns doentes apresentam níveis baixos persistentes de ADN do CMV no plasma ou no sangue total e nunca desenvolvem doença ou recidiva do CMV. Nestes indivíduos, é mais útil acompanhar as tendências dos valores da carga viral ao longo do tempo do que avaliar a significância de qualquer dado valor da carga viral. Os padrões de carga Viral que são preocupantes para vírus resistentes ao fármaco incluem aqueles que não diminuem após 2 semanas de terapêutica adequada , aqueles com um patamar na taxa de declínio da carga viral, e aqueles que têm uma queda inicial e, em seguida, um aumento subsequente na carga viral durante a terapêutica. Estes doentes devem ser avaliados para detecção de vírus resistentes sequenciando os genes UL97 e/ou UL54 (polimerase) directamente a partir de uma amostra plasmática.
os testes de carga viral do ADN CMV são concebidos de modo a não contraírem reacções com outros herpesvírus. Num doente imunocomprometido, a detecção de 2 herpesvírus, por exemplo, o vírus CMV e o vírus Epstein-Barr, reflecte a reactivação de ambos os vírus e não se deve à reactividade cruzada.
