Arabidopsis cmt3 chromomethylase mutações bloco não-CG metilação e o silenciamento de um gene endógeno | Jiotower

Resultados e Discussão

Para identificar os fatores que controlam a metilação e a silenciar do WS PAI genes, isolada de um mutante variante do WS, pai1C251Y, em que o silenciamento das metilado singlet PAI2 gene pode ser visualizado pela intensidade de um azul fluorescente fenótipo da planta, sob ultra-violeta (UV) da luz (Bartee e Bender, 2001). Na estirpe pai1C251Y, as únicas fontes potenciais de actividade enzimática de PAI são o gene PAI1, que é mutilado por uma mutação missense, e o gene PAI2, que é silenciado. Devido a esta deficiência de PAI, a estirpe acumula intermediários de vias triptofanas fluorescentes, bem como exibindo pigmentação de folhas amarelo-verde, tamanho reduzido, aumento da Bush, e fertilidade reduzida. No entanto, as mutações do segundo local que aliviam o silenciamento PAI2 Irão suprimir os fenótipos deficientes em PAI (Bartee e Bender 2001). Assim, nós mutagenizamos a estirpe pai1C251Y e rastreamos para plântulas com fenótipos fluorescentes fracos suprimidos. Como tela secundária, testamos a metilação de PAI por análise de blot do Sul com enzimas de restrição sensíveis à metilação. Especificamente, nós analisamos metilação com os isoschizômeros HpaII e MspI, que reconhecem a sequência 5′-CCGG-3′. A gaapi é sensível à metilação das citosinas internas (CG) e externas (GNC), enquanto que a MspI só é sensível à metilação das citosinas externas. Estas enzimas dividem-se uma vez em cada WS PAI locus e revelam tanto a densidade como o padrão de metilação para cada gene (Bender e Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

a partir desta estratégia de pré-selecção isolámos 11 alelos de perda de função no gene CMT3 (ver abaixo e materiais e métodos). Os mutantes cmt3 no fundo pai1C251Y apresentaram uma forte redução da fluorescência no desenvolvimento precoce da plântula e uma redução parcial da fluorescência em plantas adultas, com aumento do tamanho, diminuição da vegetação e aumento da fertilidade (Fig. (Figo.1).1). Estes isolados fluorescentes intermédios do cmt3 não voltaram à não fluorescência, que é o diagnóstico da perda de metilação residual PAI2 (Bender e Fink 1995), numa frequência detectável. Eles apresentaram um aumento parcial da clivagem com Gaapi e um forte aumento da clivagem com MspI para os genes de PAI em relação ao pai1C251Y parental(Fig. (Figo.2A).2A). O padrão de clivagem sugere que os mutantes cmt3 foram mais afetados na manutenção da metilação de GNC dos genes PAI. Para determinar se os mutantes cmt3 também afetaram a metilação de uma sequência genômica altamente repetida, nós censuramos o blot Gaapi/MspI Southern com uma sonda para as sequências de repetição (CEN) associadas ao centrômero de 180 bp (Vongs et al. 1993). Esta sonda revelou pouco efeito sobre a clivagem Gaapi, mas aumentou a clivagem MspI, consistente com o padrão observado para os genes da GAAP(Fig. (Figo.2B).2B). Um padrão semelhante de clivagem mspi aumentada também foi observado no ADNR repetido (dados não mostrados). Todos os alelos de 11 cmt3 testados tinham padrões de metilação idênticos nestes ensaios. Além disso, quando os alelos cmt3 foram separados do alelo pai1C251Y para um fundo ws de tipo selvagem, eles também exibiram padrões de metilação idênticos nestes ensaios (Fig. (Figo.2).2). Os padrões de metilação de PAI e CEN eram distintos dos padrões induzidos pelas mutações caracterizadas ddm1 e met1 deficientes em metilação (Fig. (Figo.2; 2; Bartee and Bender 2001).

para determinar mais precisamente os padrões de metilação no fundo mutante cmt3, realizámos a sequenciação genómica dos padrões de metilação nas regiões Promotoras PAI1 e PAI2 de um alelo representativo cmt3, utilizando mutagénese de bissulfito de sódio (Frommer et al. 1992). Esta análise revelou que a maioria das citosina metiladas (87% em PAI1 e 70% em PAI2) ocorreu com resíduos de CG (Fig. (Figo.3; 3; Quadro 1).1). Comparado com o promotor WS PAI1 de tipo selvagem (Luff et al. 1999; Quadro 1), 1), a metilação do CG foi reduzida 34%, a metilação do GNC foi eliminada e a metilação assimétrica foi reduzida 93%; no promotor PAI2, a metilação do CG foi reduzida 8%, a metilação do GNC foi reduzida 92% e a metilação do non-CG foi reduzida 75%. Assim, a perda da função CMT3 tem um forte efeito na manutenção do GNC e da metilação assimétrica e um efeito mais fraco na manutenção da metilação CG. Estes resultados são consistentes com relatos de que Arabidopsis CMT3 e zmet2 de milho são importantes para a manutenção da metilação de GNC em vários locais genômicos (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), mas mostram ainda que a CMT3 também é importante para a manutenção da metilação assimétrica para os genes de PAI. Este resultado implica que o CMT3 controla diretamente a metilação simétrica e assimétrica ou que a redução da metilação simétrica no fundo mutante cmt3 causa a metilação assimétrica reduzida como uma consequência secundária. Uma vez que as sequências metiladas no promotor e no primeiro exon do gene repórter PAI2 (∼370 bp) contêm apenas 16 motivos CG dispersos, a perda de metilação não-CG hipometiliza significativamente esta região do gene (Fig. (Figo.3), 3), contabilizando a expressão aumentada PAI2 no mutante supressor.

o locus mutante cmt3 nos isolados supressores pai1C251Y cmt3 foi mapeado por cruzamentos com a estirpe polimórfica Nd-0, que tem um arranjo semelhante de genes PAI densamente metilados como encontrado em WS (Melquist et al. 1999). F2 progênie com fenótipos fracamente fluorescentes diagnóstico de homozigosidade para pai1C251Y e cmt3 foram identificados por inspeção visual sob luz UV e confirmados pela MspI Southern blot para Forte clivagem de PAI semelhante à observada nos isolados supressores parentais. Uma população de mapeamento de plantas F2 que cumpriram estes critérios foi então usada para marcar loci genômico ligado ao fenótipo suprimido. A análise cartográfica revelou uma ligação a um único locus no braço inferior do cromossoma 1. Como o gene da citosina metiltransferase putativa CMT3 mapeia este locus, focamo-nos neste gene como candidato. Dentro de cada população de mapeamento, encontramos uma ligação completa a um marcador polimórfico que está dentro de 100 kb do gene CMT3. Para confirmar que o gene CMT3 foi de facto o local das mutações supressoras de metilação, clonámos e sequenciámos o gene dos 11 isolados mutantes. A sequenciação revelou uma única alteração de base na sequência de codificação CMT3 em cada isolado. Três dos alelos mutantes afectaram aminoácidos absolutamente conservados no domínio catalítico da metiltransferase, incluindo o alelo representativo cmt3G456D utilizado na sequenciação do bissulfito. Previu-se que outro alelo terminaria prematuramente a proteína. Dois alelos criaram mutações de junção. Os restantes cinco alelos afectaram aminoácidos entre a metiltransferase motif IV e o C terminus da proteína que são altamente conservados entre os genes CMT (Fig. (Figo.4).4).

para confirmar que o gene CMT3 era o locus mutante, transformámos os isolados pai1C251Y cmt3 com um clone genómico ws selvagem do gene CMT3. As mudas transformantes eram fortemente fluorescentes, da mesma forma que as da estirpe pai1C251Y (Fig. (Figo.1).1). As linhas transformantes avaliadas pela análise Southern blot na geração T2 mostraram remetilação do gene PAI2 aos níveis observados na estirpe pai1C251Y original (dados não apresentados). Assim, o gene clonado CMT3 poderia complementar os defeitos mutantes de metilação. Como um controle, o representante pai1C251Y cmt3G456D mutante também foi transformado com um clone genômico ws selvagem do gene CMT2. As mudas transformantes CMT2 eram fracamente fluorescentes, da mesma forma que as da estirpe parental não traduzida (Fig. (Figo.1),1), e não exibiu remetilação detectável de PAI2. Esta análise mostra que o CMT2 não pode substituir a função CMT3. A este respeito, é interessante notar que a CMT2 difere da CMT3 principalmente na sua sequência N-terminal (Fig. (Figo.44).

estirpes Arabidopsis com deficiências caracterizadas anteriormente no gene DDM1 relacionado com o factor de remodelação da cromatina SWI2/SNF2 (Jeddeloh et al. 1999) ou o gene da citosina metiltransferase relacionado com o Dnmt1 apresentam anomalias progressivas do desenvolvimento (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). A nossa análise preliminar das estirpes de seis gerações de cmt3 pai1C251Y e cmt3 de duas gerações não revelou uma segregação óbvia das alterações morfológicas. Esta diferença entre a cmt3 e outros mutantes deficientes em metilação é susceptível de reflectir o facto de a metilação do CG ser mantida a um grau mais elevado na cmt3 do que na ddm1 ou na met1 (Fig. (Figo.2; 2; Bartee and Bender 2001). Porque muitos dos locais endógenos metilados no genoma Arabidopsis, como o CEN repete (Fig. (Figo.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), e o promotor do gene do domínio homeo da FWA (Sobpe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), carry primarily CG methylation, cmt3 mutations would not expected to strongly affect these loci. Em vez disso, o CMT3 mais provavelmente atua como uma metilase de reforço que adiciona uma camada extra de metilação a determinadas regiões genômicas, como os genes PAI, em que o aumento da densidade de metilação leva ao aumento do silenciamento. Um modelo específico é que a camada basal de metilação CG fornecida por outras funções, como o MET1, poderia servir como um guia para o CMT3, que então decoraria a camada basal com CG extra e metilação não-CG. O recrutamento de CMT3 para regiões específicas poderia envolver interações de proteínas cromatinas com o motivo cromodomain (Henikoff e Comai 1998), juntamente com interações mediadas pelas sequências n-terminais únicas.

porque fungos como Neurospora crassa e Ascobolus immersus podem manter metilação não-CG (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), estes organismos podem codificar genes CMT. Inversamente, porque animais como os seres humanos e os ratos não possuem metilação não-CG, prevê-se que estes organismos não possuem genes CMT, como é o caso a partir de análises de bases de dados de sequência atuais. A aparente ausência de metilases semelhantes a CMT em genomas animais (Finnegan e Kovac 2000) sugere que os animais desenvolveram mecanismos alternativos para reforçar os Estados cromatínicos.