Prospect of Stem Cell Condicioned Medium in Regenerative Medicine

Abstract

Background. O meio condicionado derivado de células estaminais tem uma perspectiva promissora de ser produzido como produtos farmacêuticos para a medicina regenerativa. Objectivo. Investigar vários métodos para obter o meio condicionado derivado de células estaminais (CM) para obter uma visão sobre a sua perspectiva de aplicação em várias doenças. Meios. Revisão sistemática usando palavras-chave “célula-tronco” e “meio condicionado” ou “secretome” e “terapia”.”Dados relativos a condições/doenças tratadas, tipo de célula que foi cultivada, meio e suplementos para cultura as células, condição de cultura, processamento CM, fatores de crescimento e outras secreções que foram analisadas, método de aplicação, e resultado foram anotados, agrupados, tabulados e analisados. Resultado. A maioria dos CM usando estudos mostrou bons resultados. No entanto, os vários CM, mesmo quando eram derivados do mesmo tipo de células, foram produzidos por condições diferentes, ou seja, de passagem diferente, meio de cultura e condição de cultura. Os rendimentos do fator de crescimento dos vários tipos de células estavam disponíveis em alguns estudos, e o número de células que era necessário para produzir CM para uma aplicação poderia ser calculado. Conclusao. Vários suportes condicionados derivados de células estaminais foram testados em várias doenças e, na sua maioria, mostraram bons resultados. No entanto, devem ser realizados métodos de produção normalizados e validações da sua utilização.

1. Introdução estão a acumular-se dados sobre a utilização de células estaminais em várias doenças. Alguns estudos relataram efeitos benéficos da terapia com células estaminais em doenças degenerativas tais como enfarte do miocárdio e revelaram que as células estaminais causam reparo de tecidos devido à sua capacidade de segregar fatores tróficos que exercem impacto benéfico sobre o tecido danificado, em vez de sua capacidade de diferenciar-se nas células necessárias . Vários estudos sobre factores secretados derivados de células estaminais mostraram que o factor secretado isoladamente sem a própria célula estaminal pode causar reparação tecidular em várias condições que envolveram danos nos tecidos/órgãos. Os fatores secretados são referidos como secretome, microvesículos ou exossomo e podem ser encontrados no meio onde as células-tronco são cultivadas; assim, o meio é chamado de meio condicionado (CM) .

a utilização de secretome contendo CM tem várias vantagens em comparação com a utilização de células estaminais, uma vez que CM pode ser fabricado, liofilizado, embalado e transportado mais facilmente. Além disso, uma vez que é desprovida de células, não há necessidade de corresponder ao dador e ao receptor para evitar problemas de rejeição. Portanto, o meio condicionado derivado de células estaminais tem uma perspectiva promissora de ser produzido como produtos farmacêuticos para a medicina regenerativa.

até o momento, nenhum ensaio clínico, utilizado CM para uma determinada doença tem sido relatada, com a exceção de dois estudos-piloto sobre o uso de tecido adiposo derivada de células-tronco mesenquimais CM para os folículo de cabelo regeneração e fração de dióxido de carbono que resurfacing a cicatrização de feridas em humanos, que mostrou bons resultados. O uso de CM para terapia é muito atraente e pode estar crescendo em um futuro próximo, como estudos sobre o uso de CM para várias doenças estão acumulando . O meio condicionado contém vários factores de crescimento e agentes regenerativos tecidulares, que foram secretados pelas células estaminais. O fato de que as células estaminais secretam vários fatores de crescimento também foi demonstrado por vários estudos proteômicos, que revelaram a presença de vários fatores de crescimento e outras citocinas no CM .

no Entanto, vários estudos relataram o uso de vários tipos de células-tronco e vários métodos para obter o CM para curar vários tipos de doenças degenerativas em vários modelos animais. Portanto, esta revisão sistemática teve como objetivo investigar os vários métodos para obter o CM e as várias doenças que foram tratadas, para obter uma visão sobre os vários tipos de CM e seu benefício aplicação em várias doenças.

2. Materiais e Métodos

realizou-se “todos os textos” pesquisas sem restrição de horário em 23 de janeiro de 2014, na base de dados Pubmed/Medline, utilizando as palavras-chave “células-tronco” e “condicionados médio” ou “secretome” e “terapia”, “todos” texto de pesquisas na biblioteca Cochrane (ensaios), utilizando palavras-chave “secretome” ou “condicionado médio”, e “todos os textos” pesquisas em ClinicalTrials.gov usando palavras-chave “células-tronco” e “condicionados médio” ou “secretome” e “terapia.”Além disso, foram adicionados artigos relevantes existentes em nossa biblioteca.Os critérios de inclusão são todos os estudos que utilizaram CM para uma determinada doença. Os critérios de exclusão são estudos que não contêm dados completos sobre a condição do indivíduo/modelo de doença, fonte de CM, e resultados do tratamento com CM.

coleta de Dados é a seguinte: tratado condições/doenças, tipo de célula que era culta, detalhada da composição do meio e suplementos que foi utilizado para cultura de células, cultura, condição (hipóxia ou normoxia) para obter o CM, CM processamento, fatores de crescimento e outras secreções que foram analisados; método para o modo de aplicação e o resultado da CM de aplicação foram observados, agrupados e tabulados.

a síntese de dados é a seguinte: os dados foram agrupados de acordo com a doença tratada e os tipos de células que foram utilizados para produzir o CM. Além disso, para saber o fator de crescimento dos rendimentos dos vários tipos de células, quando disponível, fator de crescimento de níveis foram tabulados e agrupados de acordo com os tipos de células que rendeu o fator de crescimento contendo condicionado e médio, em relação ao número de células, tipo e duração da cultura, e o processamento dos condicionado e médio. Quando os dados estavam disponíveis, foi calculado o número de células necessárias para produzir o CM para uma aplicação.

3. Resultados e discussão

temos 39 artigos que cumpriam os critérios de inclusão, e 7 foram excluídos devido a dados incompletos. Várias condições / doenças foram tratadas por vários CM derivados de células e mostravam resultados promissores (Tabela 1).

os vários meios condicionados, mesmo quando eram derivados do mesmo tipo de células, foram produzidos por condições diferentes, isto é, a partir de passagens diferentes, número de células, meio de cultura e condição de cultura (Tabela 2). O Fator de crescimento dos vários tipos de células pode ser visto na Tabela 3, e o número de células que é necessário para produzir CM para uma aplicação pode ser visto na Tabela 4.

Vários estudos mostraram que condicionado médias foram testadas em vários tipos de doenças/condições (Tabela 1) , que é, alopecia , aguda e crônica de membro posterior de isquemia aguda e crônica, cicatrização de feridas , miocárdio, enfarte , lesão hepática aguda/falha , cerebral, lesão de isquemia/acidente vascular cerebral , lesão medular , lesão pulmonar , óssea e defeito , e mostrou melhoria das condições. Além disso, a doença renal crónica que foi tratada utilizando células estaminais mesenquimais derivadas de células estaminais embrionárias humanas (huESC-MSC) CM mostrou diminuição da pressão arterial sistólica e proteinúria e melhoria das lesões tubulares e glomerulares, fluxo sanguíneo renal e taxa de filtração glomerular . No entanto, a nefropatia que foi tratada utilizando CM a partir do sangue do cordão umbilical humano, células estaminais somáticas irrestritas (huUCB-USSC) ou células estaminais mesenquimais da medula óssea do Ratinho (mBM-MSC) não mostraram melhoria nos níveis séricos de ureia e creatinina, danos histopatológicos e pontuação da actividade física . Além disso, a prevenção do cancro utilizando células estaminais da linha de células estaminais mesenquimais humanas mostrou um aumento da proliferação e vascularização de células tumorais .

nos dois casos de doença renal, pode concluir-se que CM a partir de hu-ESC-MSC pode melhorar a condição, e o nível necessário do factor de crescimento é presumivelmente suficiente, uma vez que a transformação CM inclui um passo de concentração de 25 tempos . No entanto, para hu-UCB-USSC ou mBM-MESTRADO-CM, falta de dados referentes CM de processamento e o fator de crescimento do nível de CM impedir que outras análises, para concluir se a falha para melhorar a condição é devido a falta de fator de crescimento ou devido ao nível de fatores de crescimento que foi muito baixa para dar um efeito.

3.1. Meio de cultura e suplemento

alguns estudos utilizaram soro fetal bovino ou outro suplemento contendo meio completo, enquanto outros estudos utilizaram meios sem soro. Além disso, os meios basais utilizados foram variáveis, por exemplo, aMEM, DMEM, DMEM/F12, M199, EBM2, EGM-2, in vivo 15, ou meio quimicamente definido, e o mesmo tipo de célula pode ser cultivado em diferentes tipos de meio basal (Tabela 2). O meio de cultura em cultura in vitro representa o microambiente na condição in vivo e pode determinar o destino celular e, portanto, a secreção celular . Portanto, o mesmo tipo de células pode secretar diferentes níveis de fatores de crescimento quando foram cultivadas em diferentes meios, como pode ser visto na Tabela 3 .

3.2. A duração da cultura

a produção de CM varia na duração da cultura de 16 horas a 5 dias (Quadro 3). No caso de se utilizar um meio completo, a curta duração da cultura pode deixar determinados factores de crescimento derivados do soro que não foram consumidos pelas células e podem aumentar o nível do factor de crescimento ou, pelo contrário, suprimir a secreção do factor de crescimento pelas células. A possibilidade da presença de fator de crescimento residual do meio pode ser vista em um estudo, que mostrou que o meio sem célula continha um nível TGF-b1 de pg/mL (Tabela 3) .

3.3. Condição de cultura

a maioria dos estudos produziu CM em cultura monolayer, mas vários estudos utilizaram culturas esferóides (Tabela 3). As culturas esferóides necessitam de um manuseamento e equipamento especiais (balão de spinner), mas produzem mais células em comparação com culturas convencionais de monocamadas e, por conseguinte, factores mais segregados (Quadro 4). Além disso, as células localizadas no centro do esferóide podem estar em condição hipóxica relativa em comparação com as células na superfície, aumentando assim ainda mais o rendimento de certos fatores de crescimento.

3.4. O papel do Factor secretado na melhoria das doenças

várias citocinas foram secretadas pelas células estaminais no CM, e desempenharam um papel na melhoria de várias doenças/condições. Estas citoquinas podem ser agrupadas em factores de crescimento, citoquinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, e outras citoquinas. Vários estudos usaram vários métodos para avaliar várias citocinas no CM condicionado, desde os testes ELISA convencionais até os métodos de análise proteômica .

3.4.1. Fatores de crescimento

além disso, os estudos que analisaram vários factores de crescimento relataram a presença de vários fatores de crescimento, que foram produzidas por várias células-tronco em seus condicionado média (Tabela 3), exceto para o ser humano MSC (Lonza) que não secretam FGF-2, PDGFBB, BMP-2, e SDF-1, mas secretado IGF-1, VEGF, TGF β1, e HGF . Além disso, diferentes condições de cultura e meio podem produzir diferentes níveis de secreções do fator de crescimento .

3.4.2. Citoquinas pró e Anti-inflamatórias

3.4.3. Outras Citocinas

3.5. Tradução do uso do meio condicionado em pacientes

em meio condicionado, vários fatores podem estar presentes como um cocktail e agir em conjunto para promover a regeneração. Portanto, é importante analisar um conjunto completo de fatores de crescimento e níveis de citocina para cada tipo de meio condicionado derivado de células estaminais e conhecer a condição de cultura, processamento condicionado de meio, e doenças/condições que são sensíveis a um certo tratamento condicionado médio. Quando o conteúdo das várias citocinas em um determinado meio condicionado é conhecido, o resultado do meio condicionado em uma determinada doença/condição pode ser determinado, e o caminho para a tradução em pacientes é aberto.

de estudos que analisaram o nível VEGF podemos concluir que a maioria das células estaminais segregam VEGF. Como VEGF desempenha um papel na angiogênese que é importante na regeneração de tecidos/órgãos feridos/danificados, vários meios condicionados derivados de células estaminais são capazes de curar várias doenças e terá mais impacto sobre doenças com isquemia. Além disso, VEGF pode prevenir apoptose em estado hipóxico, evitando assim danos adicionais .

além disso, FGF2 é um fator angiogênico mais potente em comparação com VEGF, com efeito adicional na proliferação de fibroblastos, preadipócitos e células estaminais endoteliais, epiteliais e neurais, na migração de células gliais e miogênicas derivadas da crista neural e na diferenciação de células neuroepiteliais em neurônios maduros e células gliais .

outros fatores de crescimento contribuem para a regeneração dos órgãos dos tecidos feridos/danificados, com ênfase especial na proliferação, ou seja, PDGF para o tecido conjuntivo, glial e outras células, EGF para as células mesenquimais, gliais e epiteliais, e IGF-I e IGF-II para vários tipos de células . Além disso, PlGF que é um membro da família VEGF aumenta a atividade do VEGF in vitro e in vivo , KGF inibe o estresse oxidativo induzido por células epiteliais morte , NGF promove neurites conseqüência neurais, célula de sobrevivência , BDNF é neuroprotetor, promove a sobrevivência das células e reduz astroglial formação de cicatriz , e alguns fatores de crescimento, incluindo HEGF, FGF-7, FEG, e HGF promover a regeneração do fígado .

citoquinas pró-inflamatórias que desempenham um papel na regeneração são IL-1b devido ao seu papel de protecção hepática , IL-8 devido à sua actividade angiogénica , e IL-9 devido à actividade de promoção da cicatrização de feridas . Além disso, as citoquinas anti-inflamatórias previnem a inflamação e promovem a regeneração hepática .

receptor MCSF (MCSFR) promove o crescimento e desenvolvimento do trofoblasto mielóide, fagocito mononuclear e placentário, e o PDGFR pode interagir com várias moléculas sinalizadoras ou integrina para causar proliferação celular , motilidade, diferenciação ou sobrevivência por inibição da apoptose .

além disso, um fator pode contribuir para mais de um modo de ação regenerativa, tais como MCP-1 que está envolvido na angiogênese e atividade de proteção hepática . Além disso, para que a produção de CM seja aplicada em várias doenças humanas, os dados de Estudos em animais que mostraram resultados promissores são muito valiosos.

3.5.1. Produção de CM para a Tradução em Várias Doenças Humanas

Para utilizar CM para várias doenças humanas, método de produção da CM precisa ser padronizado em termos de tipo e número de células necessárias para produzir o CM, meio de cultura e condição e condicionado médio de processamento. Além disso, o volume e o modo de entrega também são importantes. Como vários estudos utilizaram vários números e tipos de células e várias doses de CM, é importante conhecer o número de células que renderam o CM para uma aplicação, que pode ser interpolada para estudos humanos. Portanto, na Tabela 4 resumimos todos os dados que podem ser necessários para a interpolação em estudos em humanos, isto é, doenças que foram tratados, a espécie e a idade ou peso corporal do animal, tipo de célula, meio de cultura e condições, o número de células para produzir CM para uma aplicação, volume e modo de aplicação. Além disso, na Figura 1 são resumidas várias aplicações possíveis de CM para várias condições.

Figura 1

Várias aplicações possíveis de CM para várias condições.

além disso, para a tradução em pacientes, é muito importante analisar e notar os vários conteúdos de citocina dos vários meios condicionados. Além disso, para cada meio condicionado com conteúdo de citocina conhecido, a validação de seu uso em várias doenças precisa ser realizada. Por último, a possibilidade de promoção do cancro existente deve ser testada para cada CM, devendo ser tomadas precauções antes da terapêutica com CM para garantir que o receptor está livre de cancro.

as vantagens da produção de vários CM para os pacientes residem na possibilidade de produção em massa por empresas farmacêuticas, quando os métodos de produção foram padronizados. Os meios condicionados não são como as células estaminais que necessitam de uma instalação de boas práticas de fabrico (GMP) para serem aplicados aos doentes . Quando o CM foi embalado corretamente, ele pode ser transportado facilmente como drogas e não precisa de criopreservação, como o que as células estaminais precisam. No entanto, em comparação com as células estaminais que podem sobreviver por um período bastante longo, o CM precisa de ser administrado com mais frequência, uma vez que as semi-vidas das citocinas e dos factores de crescimento são , na sua maioria, mais curtas, o que é uma desvantagem para os doentes, mas dará mais lucro às empresas farmacêuticas.

4. Conclusão

vários suportes condicionados derivados de células estaminais foram produzidos por vários métodos e processamento e testados em várias doenças e, na sua maioria, mostraram bons resultados. No entanto, métodos padronizados para a produção de vários meios condicionados e validações de seu uso em várias doenças precisam ser conduzidos.

conflito de interesses

o autor declara que não há conflito de interesses em relação à publicação deste artigo.

reconhecimento

este estudo foi financiado pela bolsa de pesquisa do Ministério Indonésio da Educação e Cultura (Pusnas 2014), Contrato n. º 2218/H2. R12 / HKP.05.00/2014.