síntese de colagénio
regulação da síntese de colagénio ósseo
síntese de colagénio em culturas de órgãos de calvariae de roedores e culturas de células foi avaliada utilizando vários testes diferentes . No doseamento mais utilizado, calvariae e células são incubadas com prolina marcada radioactivamente durante várias horas antes do fim da cultura. A incorporação de prolina marcada radioactivamente na proteína digestível da colagenase (etiquetagem CDP) e na proteína não-colagénica (rotulagem NCP) é medida em extractos das culturas utilizando colagenase bacteriana altamente purificada . A percentagem de síntese de colagénio é calculada a partir dos valores CDP e NCP depois de corrigir a maior abundância de prolina em colagénio em relação às proteínas não colagénicas . A produção de colagénio também pode ser determinada pela medição do teor de hidroxiprolina de culturas de células ou órgãos, uma vez que a hidroxiprolina é praticamente exclusiva dos colagénios. Estes métodos não distinguem entre diferentes tipos de colagénio fibrilar. No entanto, o colagénio sintetizado por culturas de órgãos ósseos e a maioria das culturas de células osteoblásticas é em grande parte do tipo I (>95%), de modo que o valor de rotulagem da CDP geralmente reflecte a síntese de colagénio tipo I. Se desejado, a produção de diferentes tipos de colagénio pode ser distinguida por cromatografia de permuta iónica e por electroforese em gel de poliacrilamida de extractos radiomarcados de culturas de células ou órgãos . A expressão do colagénio tipo I em culturas de células humanas foi também avaliada através da medição da secreção do propeptídeo procolagénio I C-terminal . Por último, foram utilizadas sondas cDNA específicas em primers específicos do Norte da coagulação e do alelo em ensaios de reacção em cadeia da transcriptase reversa-polimerase, para avaliar a expressão de mRNA do colagénio em modelos ósseos. A medição do efeito de 1,25(OH)2D3 na síntese do colagénio e nos níveis de mRNA deu resultados comparáveis utilizando estes diferentes ensaios.
1,25 (OH)2D3 inibe a síntese do colagénio em culturas de órgãos de calvariae de rato fetal de 21 dias e calvariae de ratinho neonatal com pouco ou nenhum efeito na síntese de proteínas não colagénicas. A inibição máxima da síntese do colagénio por 1,25(OH)2D3 em calvariae de rato (cerca de 50%) ocorre a 10 nM . 1,24 R, 25 – (OH)3D3 também inibe a síntese do colagénio, mas é menos potente do que 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 e 24R, 25 (OH)2D3 não alteram a síntese do colagénio abaixo de 100 nM . Os metabolitos da vitamina D inibem a síntese do colagénio e estimulam a reabsorção dos ossos longos do rato fetal com potências relativas semelhantes que se correlacionam com a afinidade dos metabolitos para os VDRs esqueléticos . Para determinar a selectividade celular da inibição 1,25(OH)2D3 da síntese do colagénio, as culturas de órgãos do rato fetal calvariae foram tratadas com 1,25(OH)2D3 durante 22 h e, em seguida, incubadas com prolina tritiada para os 2 h finais da cultura. O osso central (osteoblastos maduros) foi dissecado livre do periósteo (osteoprogénitores menos maduros e fibroblastos) e ambos os compartimentos foram analisados separadamente para a incorporação de prolina tritiada. 1,25 (OH)2D3 diminui a síntese de colagénio no osso central, mas não no periósteo, indicando selectividade do efeito 1,25(OH)2D3 para os osteoblastos maduros . Usando um protocolo vivo em que neonatal de ratos foram dadas várias injeções de tritiated prolina para radiolabel recém-sintetizado matriz óssea, 25 ng de 1,25(OH)2D3 dada nos dias 1, 3 e 5 inibiu a síntese de matriz óssea, avaliada por histomorphometry de autoradiographs de tibia e calvariae .
1,25 (OH)2D3 também inibe a produção de colagénio nas células osteoblásticas osteosarcoma do rato ROS 17/2.8 , nas células osteoblásticas primárias do rato e do rato , e numa linha celular de osteoblastos murinos imortalizada (MMB-1) . 1, 25 (OH)2D3 tem um efeito inibitório maior sobre a síntese do colagénio tipo I durante o crescimento da fase logarítmica das células osteoblásticas murinas primárias do que na confluência, talvez porque as células proliferantes continham mais VDRs . Da mesma forma, a inibição de 1,25(OH)2D3 da síntese do colagénio é maior em culturas esparsas de células MMB-1 que têm níveis VDR mais elevados do que as células MMB-1 confluentes . A inibição da síntese do colagénio de 1,25(OH)2D3 é equivalente nas células osteoblásicas primárias dos ratos esparsos e confluentes , mas o número de VDR não se alterou durante o crescimento das células . Em conjunto, estes dados mostram que a extensão da inibição da síntese de colagénio em 1,25(OH)2D3 é largamente determinada pela quantidade celular de VDRs. 1, 25 (OH) 2D3 inibe os níveis de mRNA colagénio durante a fase proliferativa de culturas a longo prazo de células osteoblásticas primárias no rato e impede a formação de nódulos ósseos mineralizados por estas culturas . Estes estudos mostram que 1,25(OH)2D3 inibe a diferenciação dos osteoprogenitores que formam nódulos mineralizados em culturas celulares osteoblásticos primárias no rato . No entanto, a inibição da formação de nódulos por 1,25(OH)2D3 pode ser secundária à supressão da síntese de colagénio tipo I nas culturas.
em contraste com os efeitos inibitórios descritos acima, 1,25 (OH)2D3 estimula transitoriamente o colagénio e a síntese de proteínas não-colagénicas (cerca de duas vezes), que atinge entre 12 e 24 h, na linha celular osteoblástica imortalizada murina MC3T3-E1 . Neste estudo, a percentagem de colagénio sintetizado pelas culturas (colagénio em relação à síntese proteica total) não foi notificada.; como resultado, não foi possível determinar a seletividade do efeito 1,25(OH)2D3 para a síntese de colagénio. 1, 25 (OH)2D3 também aumenta a expressão do colagénio na linha celular osteoblástica osteosarcoma humana MG-63 e nas culturas primárias de células osteoblásticas humanas . Curiosamente, o aumento da síntese de colagénio em 1,25(OH)2D3 nas células MG63 é bloqueado pela proteína 5 de ligação do factor de crescimento semelhante à insulina, que interage directamente com o VDR e previne a heterodimerização com o receptor RXR do retinóide X. No entanto, em outros estudos, 1,25 (OH)2D3 tem sido mostrado para diminuir a percentagem de síntese de colagénio em células MC3T3-E1 . MC3T3-E1 e MG-63 representam células preosteoblásticas que sofrem diferenciação osteogénica in vitro com ácido ascórbico; 1,25(OH)2D3 inibe o crescimento celular e aumenta a expressão da osteocalcina e a actividade da fosfatase alcalina em ambas as linhas celulares. As células MC3T3E1, como a maioria das linhas celulares osteoblásticas imortalizadas, apresentam uma variação fenotípica significativa . Portanto, alguns destes resultados discrepantes podem ser devido a variações nas células utilizadas para os experimentos. Coletivamente, estes dados sugerem que 1,25 (OH)2D3 pode atuar como uma hormona diferenciadora nas células precoces da linhagem osteoblastos, o que resulta em aumento da expressão do colágeno tipo I. Em contraste, 1,25 (OH)2D3 inibe a expressão do colagénio tipo I nos osteoblastos maduros.
