Transformação do pesticida recalcitrante clordecona por Dessulfovibrio sp.86 com mudança da desclorinação de abertura interlaboratorial para a actividade de sulfidação redutiva | Relatórios Científicos

isolamento de Dessulfovibrio sp.86
genoma analysis of Dessulfovibrio sp.86
Dessulfovibrio sp.86 degrada a clordecona em produtos de transformação conhecidos, bem como um composto contendo enxofre inesperado
Síntese dos chlordecthiol padrão e a confirmação de que a transformação do produto F1 é idêntico ao chlordecthiol
A capacidade de Dessulfovibrio sp.86 para degradar produtos de transformação de clordecona
Investigation of the incubation conditions leading to bacterial reductive sulfidation
relevância Ambiental da sulfidação redutora da clordecona

isolamento de Dessulfovibrio sp.86

isolamento de Dessulfovibrio sp.86 foi alcançado a partir do consórcio de degradação da clordecona 865 usando condições de redução de sulfato. Como o consórcio bacteriano 86, capaz de transformar a clordecona, foi obtido a partir de um meio mineral enriquecido (MM) chamado MM + 5, complementado com clordecona, a principal composição química foi mantida, mas doadores de elétrons e aceitadores foram modificados. Várias formulações de meios usadas para enriquecer bactérias redutoras de sulfato utilizam ácidos orgânicos, por exemplo, lactato,como fontes de carbono e energia (doador de elétrons) e sulfato que é usado como eletron-aceitador para growth15,16,17, 18. Neste contexto, o piruvato no meio líquido mm + foi substituído por lactato e sulfato foi adicionado (MMD meio líquido, ver secção “métodos”). O enriquecimento espalhou-se pelo ágar-ágar-do-marrom e as colónias de bactérias do tipo vibrio (observadas ao microscópio óptico) foram ainda mais purificadas através de duas riscas de placas adicionais (Fig. S1). Verificou-se que uma estirpe bacteriana isolada era idêntica à Dessulfovibrio sp.86 do consórcio 86 baseado em 100% de identidades dos seus genes 16S rRNA (1538 bp cada).

genoma analysis of Dessulfovibrio sp.86

todo o genoma consiste num único cromossoma circular 3,464,070 bp. A análise checkm19 realizada com 61 genomas e 284 linhagens indica que o genoma pertence à Deltaproteobacteria e que a completude do CheckM é de 100% (ausência de marcador de zero essencial). O teor médio de G + C para o ADN é de 58,06%. Um total de 3 342 sequências de codificação de ADN (CDSs) foram previstas para o cromossoma, 4 pseudogenes e 10 RNAs diversas (diversos Rna), 3 operões rRNA e 54 genes tRNA.

os três genes rRNA 16S de Dessulfovibrio sp.86 são idênticos. Seus melhores hits de explosão (NCBI) foram de Dessulfovibrio sp. clones de células de combustível microbianas, tais como MFC63A04 (número de Adesão do Genbank : FJ823865; cobertura 98%; identidade 99,87%)20. Uma árvore filogenética usando o rRNA 16S disponível de bactérias cultiváveis confirmou as semelhanças entre Dessulfovibrio sp.86 e Dessulfovibrio simplex DSM4141 (Genbank 16S rRNA accession number: NR_117110; coverage 99%; identity 99, 22%; genomic sequence unavailable) (Fig. S2) 21. A nível genómico, Dessulfovibrio sp.86 classifica-se em primeiro lugar com Dessulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27.774 genome (GenBank:NC_011883). No entanto, Desulfovibrio sp.86 partilha apenas 1.408 genes (43%) com D. dessulfuricanos (mais de 80% de identidade de aminoácidos e 80% de cobertura de alinhamento). In addition, the average nucleotide identities (ANI) between Desulfovibrio sp.86 e os genomas de Dessulfovibrio sequenciados são inferiores ao valor-limite de 95% do ANI geralmente aceite para a delimitação de espécies(Fig. S3) 22. Estes resultados indicam que a Dessulfovibrio sp.86 é provavelmente uma nova espécie do filo Dessulfovibrio. A presença de duas dismutases superoxídicas e um gene da catalase é responsável pela sua tolerância relativa ao oxigénio. Como esperado, a Dessulfovibrio sp.86 genoma exibe um extenso complemento genético para o metabolismo do enxofre, abrangendo as vias respiratórias de enxofre com fontes inorgânicas como sulfato, sulfito, bissulfito e tetrationato como aceitadores de elétrons. As fontes orgânicas de enxofre podem ser fornecidas por produtos de fermentação de biomassa de enxofre (sulfoquinovose de lípidos de sulfoquinovosil) sulfoacetato, o aminoácido não proteogénico de enxofre taurina via sulfoacetaldeído, ou alcanossulfonates23.

Dessulfovibrio sp.86 degrada a clordecona em produtos de transformação conhecidos, bem como um composto contendo enxofre inesperado

a capacidade de degradação da clordecona da Dessulfovibrio sp isolada.A estirpe 86 foi investigada utilizando técnicas GC–MS (cromatografia gasosa espectrometria de massa) e LC-HRMS (Cromatografia Líquida de alta resolução espectrometria de massa) em condições de crescimento aplicadas com êxito a Dessulfovibrio sp.Isolamento (MMD líquido médio). Na2S foi usado como redutor e uma atmosfera anaeróbica N2/H2 (98/2; V/V) foi aplicada usando um sistema de porta-luvas. Estas condições de incubação levaram ao desaparecimento completo do sinal de clordecona em GC–MS e LC-HRMS, e resultaram em perfis GC–MS e LC-HRMS TP semelhantes aos obtidos com Citrobacter sp.866: monohidroclordecona A1, pentacloroindeno B1, tetracloroindenes B3-B4 e ácidos policloroindenecarboxílicos C1-C2 E C3-C4 (Fig. 1a, b). No sistema de porta-luvas, foram realizadas culturas bacterianas utilizando frascos de vidro de 100 mL com uma película porosa hidrofóbica para permitir a troca de gás e evitar a contaminação. Esta condição de incubação foi considerada como condição de “atmosfera renovada” (RA). Neste sistema, a atmosfera foi regularmente renovada com N2 / H2 (98/2; V/V) e a caixa não foi controlada termostaticamente de modo que a temperatura variou entre 25 °C e 33 ° C. para melhor controlar as condições de crescimento e degradação, Dessulfovibrio sp.As culturas foram colocadas em meio MMD utilizando frascos de vidro de 100 mL, selados com septa de borracha butílica, numa estufa a 30 ° C. Os frascos selados foram inicialmente purgados com gás N2/H2 (98/2; V/V) para assegurar a anaerobiose. Esta condição de incubação foi considerada como condições de “atmosfera confinada” (CA).

após seis semanas de incubação com clordecona, o pesticida deixou de ser detectável pelas mesmas técnicas analíticas. Concomitantemente, apareceu um único composto clorado desconhecido chamado F1. Foi detectável apenas através de GC-MS (25, 6 min) (Fig. 1c). Como nos cultores de degradação da clordecona anteriormente relatados5, 6, a principal transformação da clordecona apareceu durante a fase estacionária(Fig. 1e). Uma vez que não foi possível observar nenhum pico clorado visível em CMV-HRMS (Fig. 1d), baseamos a elucidação estrutural de F1 na interpretação de dados GC–MS (Fig. 1f). Assumindo que o padrão isotópico mais elevado centrado em m/z 507.8 continha o íon molecular, nós hipotetizamos duas possíveis fórmulas neutras para F1, C10Cl10O2H2 e C10Cl10SH2. Os fragmentos na fonte foram muito semelhantes aos observados em estruturas policloradas à base de bishomocubano, incluindo clordecona, hidrolordeconas,clordecol e mirex5,6, 24. De facto, os padrões isotópicos a m/z 201.0, 235.9 e 271.9 presumivelmente surgiu a partir da conhecida retrociclodimerização de bishomocubano na fonte e correspondeu a fragmentos C5 carregados positivamente. A comparação com simulações isotópicas limitou a possibilidade aos seguintes iões Radicais: +· +· e +·, com n = 0,1. Esta última fórmula genérica bis-oxigenada tornou-se altamente improvável, uma vez que exigia a presença de uma função gem-diol ou uma fracção gem-clorohidrina no anel ciclopentenilo que tinha de resistir às duras condições cromatográficas de GC (> 200 °C). Em vez disso, concluímos que uma fracção de enxofre, i.e. uma função tiol, estava provavelmente presente no policiclo bishomocubano. Propusemos para F1 a estrutura representada na Fig. 2a e sugeriu o nome clordectiol, o análogo de enxofre do clordecol (álcool clordecona).

Síntese dos chlordecthiol padrão e a confirmação de que a transformação do produto F1 é idêntico ao chlordecthiol

, a fim de confirmar a estrutura de F1, o padrão chlordecthiol foi sintetizado quimicamente e totalmente caracterizado. Para alcançar a sulfidação química redutiva da clordecona, foram necessários dois passos. O primeiro consistiu na conversão da função gem-diol da clordecona em equilíbrio com a correspondente cetona forme20,25 no análogo enxofre, ou seja, a fracção gem-tiol/tiocarbonil. Para realizar esta etapa, reagentes de enxofre contendo fósforo são geralmente aplicados 26,27. Aqui nós usamos decassulfeto de fósforo (P4S10) também chamado Berzelius reagent27,28 de acordo com o protocolo de Zaidi e colegas de trabalho que sintetizaram com sucesso cânhorthiol29 (Fig. 2a). O segundo passo consistiu na redução do intermediário gem-tiol usando NaBH4. Após a purificação, Obteve-se um sólido branco com um rendimento global de 73% (Fig. 2a). 1D e 2D RMN análises confirmaram a chlordecthiol estrutura: (i) dois sinais de 1H integração de cada um para um próton e acoplados (δ 3.78 ppm, d, J = 5.5 Hz e δ 2.01 ppm, d, J = 5.5 Hz), com a δ 3.78 ppm correlacionada a um 13C sinal deslocado downfield (δ 55.1 ppm) em HSQC experiência que se perfeitamente conta de que o CH metade avançar para o thiol função e (ii) um total de seis visíveis sinais de 13C refletindo o plano de simetria conservado no presente bishomocubane estrutura (Fig. 2a, figos. S19-23). Embora na transformação microbiana, F1 não pudesse ser detectado usando a ferramenta LC-HRMS nas condições desenvolvidas, uma amostra concentrada do clordectiol padrão sintético forneceu um sinal significativo. A presença de um átomo de enxofre e a fórmula neutra esperada C10Cl10SH2 foram confirmadas (Fig. 2c, d), e as fórmulas cruas C10Cl10O2H2 foram descartadas (Fig. 2b). Por último, a análise GC–MS demonstrou a combinação perfeita (ou seja, o mesmo tempo de retenção de 25,6 minutos e o mesmo espectrómetro de massa na fonte. S6) entre o padrão sintético e TP F1, atribuindo-o definitivamente como clordectiol. De fato, F1 representa o primeiro membro de uma nova família de TPs de clordecona possuindo pela primeira vez um átomo de enxofre.

A capacidade de Dessulfovibrio sp.86 para degradar produtos de transformação de clordecona

compostos A1, B1, C1-C2 e F1 representativos das quatro famílias de TPs possivelmente formados em presença de Dessulfovibrio sp.Foram sintetizados de acordo com protocolos químicos anteriormente relatados6 e desenvolvidos para F1. Cada um deles foi incubado em presença de Dessulfovibrio sp.Culturas em condições que demonstraram promover a sulfidação redutiva (frasco selado; condições CA) ou a desclorinação com abertura do anel (frasco aberto; condições ar). Foi realizada uma monitorização dual da GC-MS e da LC-HRMS de todas as amostras.

após incubação de um mês em condições CA, a 10-monohidroclordecona A1 foi completamente transformada em dois compostos clorados desconhecidos, pouco separados por GC-MS (tempos de retenção: 24,3 min F2 e 24,5 min F3, Fig. 3, figos. S7-S11). Eles mostraram um espectro de massa idêntico na fonte que era altamente similar ao padrão de fragmentação F1(Fig. S8). Todos os fragmentos detectados na fonte tornaram-se possuidores de um átomo de cloro menos do que os seus análogos no espectro de massa F1. Os compostos F2 e F3 foram assim considerados diastereoisómeros de 10-monohidroclordectiol (Fig. 3c). Isto foi confirmado pela síntese química dos dois padrões 10-monohidrocclordectiol de 10-monohidrocclordecona A1 utilizando o procedimento anteriormente aplicado para a síntese de clordecthiol F1 (figos. S24-27). Estes padrões químicos tiveram os mesmos tempos de retenção (24,3 e 24,5 min) e os mesmos espectros de massa em comparação com os F2 biológicos e F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 e F1 permaneceram inalterados mesmo após seis meses de incubação com Dessulfovibrio sp.86 em condições do CA.

Depois de seis meses de incubação em RA condições, chlordecthiol F1 foi parcialmente convertido em 10-monohydrochlordecthiols F2 e F3, e outros dois desconhecidos clorados espécies detectadas através de GC–MS, denominada F4 (tempo de retenção: 17.9 min) e F5 (tempo de retenção: 26.6 min) (Fig. 3d, Fig. S12). Nenhum destes dois compostos deu qualquer sinal detectável em LC-HRMS. A análise GC-MS permitiu propor C10Cl6SH4 como fórmula bruta para F4(Fig. S14), e C11Cl10SH4 para F5 (Fig. S15). Clordecsulfeto de metilo foi sintetizado quimicamente e totalmente caracterizado por NMR (Fig. S28-31). The perfect correspondence of GC retention times and GC mass spectra of methyl clordecsulfide and biological F5 (Fig. S13) confirma a sua identidade postulada. Notável, a estrutura de F5 (Fig. 3d) representa uma forma S-metilada de F1. A natureza exacta do F4 permanece por esclarecer (ver SI-texto suplementar). Todos os outros TPs permaneceram inalterados em condições RA.

em resumo, A1 (formado em condições RA) foi submetido a uma sulfidação redutiva tal como a clordecona; em ambas as condições de incubação, os policloroindenos (B1 e C1-C2) não pareciam ser degradáveis por Dessulfovibrio sp.86, enquanto que F1 (produzido em condições CA) poderia ser transformado em condições RA(Fig. 3).

Investigation of the incubation conditions leading to bacterial reductive sulfidation

To question the physico-chemical or physiological parameters influencing the transformations pathways of clordecone in the cultures of Dessulfovibrio sp.Foi escolhida a monitorização por CG-em (presença B1 e F1 como evidência das condições de ar e CA, respectivamente).

dois compostos inorgânicos contendo enxofre, o redutor Na2S e o aceitador de elétrons Na2SO4, estavam presentes no meio líquido MMD original. Uma primeira série de experiências em frascos selados com substituição de Na2S por outros agentes redutores, sulfurados ou não, ou seja, cisteína e citrato de titânio(III) (Tic), conduziu a um nível comparável de clordectiol F1 (Tabela 1). Foram também observados vestígios de TP B1 em todas as experiências, incluindo Na2S, o controlo positivo (Quadro 1).

Tabela 1 influência do agente redutor no perfil de clordecone TP.

um segundo conjunto de experiências foi concebido utilizando Na2S como agente redutor e aceitadores alternativos de electrões à base de enxofre em frascos selados (Tabela 2). A utilização de sulfato inorgânico enriquecido com 90% de 34S resultou num produto clordectiol que apresenta um nível de enriquecimento semelhante com 34S (90% 34S-F1 / 10% F1, Fig. S16). GC-MS analysis of culture headspace also revealed the presence of H234S and H3C34SH(Fig. S16), mostrando assim que Dessulfovbibrio sp.86 produziu H2S a partir de sulfato. Estes gases foram detectados no headspace da cultura em condições CA, usando o meio MMD, enquanto eles estavam ausentes do headspace da cultura em condições RA que correspondiam à atmosfera do porta-luvas (Fig. S17). A ausência de sulfato não inibiu a Dessulfovibrio sp.No entanto, resultou na formação de B1 (Quadro 2)5. O remplacement de sulfato por sulfito, bissulfito ou tiossulfato levou em todos os casos à formação de clordectiol F1.

Table 2 Influence of the sulfur-based electron acceptor on chlordecone TP profile.

uma terceira série de experimentos usando frascos investigou o efeito da natureza da fase de gás em contato com a cultura. Entre a condição ar utilizando frascos abertos no porta-luvas e a condição AC utilizando frascos selados no forno, diferiram vários parâmetros (natureza e volume da atmosfera, temperatura). Utilizando um sistema jar que inclui vários frascos, estudamos selectivamente o efeito da renovação da atmosfera na transformação de clordecona por Dessulfovibrio sp.86 em MMD médio. Em cada caso, frascos abertos com películas porosas hidrofóbicas foram colocados em frascos inicialmente purgados com um gás seleccionado. Todos os frascos foram incubados a 30 °C. alguns foram despejados várias vezes, para imitar o sistema do porta-luvas, enquanto outros foram mantidos fechados.

os frascos para injectáveis 1-4 continham dois frascos para injectáveis abertos idênticos cheios de MMD, clordecona e Dessulfovibrio sp.86 inóculo e um controlo abiótico negativo. Entre eles, dois frascos foram despejados duas vezes por semana, jar 1 com (N2 / H2 (98/2; V / V)), jar 2 com N2 (Fig. 4a), considerando que os frascos 3 e 4, inicialmente purgados com N2 e (N2/H2 (98/2; V / V)))), respectivamente, ficaram por preencher (Fig. 4b).

os dois últimos frascos (jar 5 e 6) continham três frascos abertos cheios de MMD, clordecona e Dessulfovibrio sp.86, mais uma cultura sem sulfato. Estes frascos foram inicialmente corados com (N2 / H2 (98/2; V / V)) e deixados sem cor durante 2 meses (Fig. 4c).

paralelamente aos frascos, dois frascos para injectáveis selados cheios com MMD sem sulfato, clordecona e Dessulfovibrio sp.86 foram inundados com H2S sintetizados extemporariamente (Fig. S4).

após incubação de dois meses a 30 ° C, o TP B1 foi detectado em frascos colocados nos frascos corados 1 e 2 (Quadro 3a), enquanto que o TP F1 só foi encontrado em frascos colocados em frascos fechados 3 e 4 (Quadro 3b). Não havia TP nos controles abióticos. Nos frascos 5 e 6, F1 estava presente tanto em sulfato quanto em Dessulfovibrio sp livre de sulfato.86 culturas abertas (quadro 3c). Da mesma forma, Dessulfovibrio sp.Culturas livres de sulfato, lavadas com H2S, mostraram níveis significativos de F1 TP, enquanto que nenhuma transformação foi observada no controle negativo (Quadro 3d).

Table 3 Influence of gas atmosphere on chlordecone TP profile.

um experimento químico adicional foi realizado para avaliar a influência de H2S na transformação de clordecona. Foi aplicado um protocolo químico clássico que permitia a formação de TPs B E C (clordecona, citrato de titânio, vitamina B12, água). Sob atmosfera N2, TPs B E C foram obtidos, no entanto sob atmosfera H2S, apenas A1 foi produzido (Fig. S18).

estes resultados mostram claramente que a formação de clordecthiol F1 requer um sistema de incubação fechado com uma atmosfera redutora. No entanto, H2 como a atmosfera inicial de gás não é obrigatória, enquanto a presença de H2S é necessária. Quimicamente, a presença de H2S impede o processo de desclorinação de abertura do anel.

relevância Ambiental da sulfidação redutora da clordecona

reinvestigámos a nossa colecção anterior de amostras ambientais contaminadas com clordecona na ilha da Martinica (oito solos e dois sedimentos de cama), nas quais foram notificados vários níveis de Clordecona TPs 6. Entre as novas amostras de TPs contendo enxofre relatadas, encontramos níveis apreciáveis de F1 nas duas amostras de sedimentos de leito (927 e 928) a uma concentração estimada em cerca de 50 µg/kg e 20 µg/kg de sedimentos húmidos, respectivamente (quadro S1). Paralelamente, os dados sobre a diversidade da população bacteriana emitidos a partir da análise de metabarcoding destas amostras (Fig. 5, Fig. S5) foram processados para recuperar um agrupamento hierárquico de amostras ambientais de acordo com a sua composição taxonómica 6. Notou-se que as bactérias redutoras de sulfato estavam muito mais presentes nos sedimentos de cama do que nos outros compartimentos, como anteriormente relatado30,31,32.

transformação do pesticida recalcitrante clordecona por Dessulfovibrio sp.86 com mudança da desclorinação de abertura do anel para actividade de sulfidação redutiva