frontiere în genetică

testul cometei alcaline (electroforeza în gel cu o singură celulă) este cea mai utilizată metodă pentru măsurarea daunelor ADN în celulele eucariote (Neri și colab., 2015). Acesta detectează pauzele de catenă (SBs) și siturile alcaline-labile la frecvențe de la câteva sute la câteva mii de pauze pe celulă—o gamă utilă din punct de vedere biologic, care se extinde de la niveluri scăzute de daune endogene până la gradul de daune care pot fi provocate experimental fără a ucide celulele. Digestia nucleoizilor, după liză, cu anumite endonucleaze de reparație specifice leziunii permite măsurarea altor leziuni decât SBs; în special, FORMAMIDOPIRIMIDIN ADN glicozilază (FPG) a fost utilizat pe scară largă pentru a detecta purinele modificate, care sunt transformate în pauze de către enzimă. Recent, (cort secvente-Guti secvente și colab., 2014) a dezvoltat un test de cometă bidimensional cu două cozi (TT-comet) care poate face diferența între pauzele de ADN monocatenar (SSBs) și dublu catenar (DSB) în aceleași comete din spermă.

de la primul raport al lui Ostling și Johanson (1984), testul comet a fost utilizat pe scară largă în testarea genotoxicității substanțelor chimice, atât în modelele in vitro, cât și in vivo. Un avantaj cu acesta din urmă este că celulele din diferite țesuturi pot fi studiate, într-o mare varietate de organisme eucariote. În ultimii 15 ani, testul comet a fost utilizat pe scară largă în Drosophila melanogaster pentru a testa genotoxicitatea substanțelor chimice (Gaiv Inktico și Sierra, 2014). Această abordare este foarte utilă, deoarece Drosophila melanogaster este un model valoros pentru toate tipurile de procese legate de sănătatea umană, inclusiv răspunsurile la deteriorarea ADN-ului.

utilizarea plantelor, precum și a unei game largi de specii terestre și acvatice în testul cometei a crescut dramatic în ultimul deceniu (Costa și colab., 2014; de Lapuente și colab., 2015; Santos și colab., 2015), în special în evaluarea riscurilor de mediu (sec). Un studiu recent de validare a indicat că testul cometei in vitro combinat cu FPG poate fi o linie complementară eficientă de dovezi în ERA, chiar și în scenarii naturale deosebit de provocatoare, cum ar fi mediile estuarine (Costa și colab., 2014).

în ultimul deceniu, producția și utilizarea materialelor de dimensiuni nano a crescut semnificativ și, în consecință, a crescut și expunerea umană la aceste tipuri de materiale. Identificarea și înțelegerea pericolelor nanomaterialelor (SNM) în ceea ce privește sănătatea umană nu este o chestiune simplă. Nu numai că compoziția chimică a NMs este responsabilă pentru genotoxicitatea lor, dar și forma, suprafața specifică, dimensiunea, distribuția mărimii și potențialul zeta determină efectele acestor materiale asupra genomului. Deși există încă o dezbatere cu privire la adecvarea testelor standard de genotoxicitate pentru studierea efectelor NMs, până în prezent cea mai utilizată metodă în nanogenotoxicologie, datorită robusteții, versatilității și fiabilității sale, a fost testul comet (Azqueta și Dusinska, 2015). Pe lângă investigarea genotoxicității radiațiilor și a diferitelor substanțe chimice, testul cometei plantelor a fost recent utilizat și pentru a studia impactul genotoxic al NPs (Santos și colab., 2015).

o aplicație suplimentară a testului comet este un instrument experimental valoros pentru biomonitorizarea umană, precum și în studiile clinice. Colectarea sângelui sau a țesuturilor nu este întotdeauna fezabilă la toți subiecții umani, iar alte surse de celule care pot fi colectate neinvaziv au fost testate cu testul comet; de exemplu, diferite tipuri de celule epiteliale (Rojas și colab., 2014), precum și sperma (cort secvente-Guti secvente și colab., 2014; Brunborg și colab., 2015).

în paralel cu dezvoltarea testului comet pentru măsurarea daunelor ADN, au fost dezvoltate teste pentru repararea ADN—ului—un element esențial în răspunsul celular genotoxic. Cea mai simplă abordare a măsurării reparării ADN-ului este tratarea celulelor cu un agent dăunător ADN și apoi incubarea acestora pentru a permite repararea să continue, măsurând cantitatea de daune rămase la intervale. O abordare alternativă, biochimică, pentru evaluarea capacității de reparare a fost descrisă în 1994 (Collins și colab., 1994) și de atunci au fost publicate diferite versiuni modificate ale testului pentru a măsura atât repararea exciziei de bază (BER), cât și repararea exciziei nucleotidice (NER) (revizuite de Azqueta și colab., 2014). Această abordare biochimică a fost aplicată pentru a studia efectele mediului, alimentației, stilului de viață și ocupației asupra capacității de reparare a ADN-ului, pe lângă investigațiile clinice (Azqueta și colab., 2014).

această abordare alternativă in vitro pentru repararea ADN-ului evaluează activitatea de reparare a unui extract celular pe un substrat ADN care conține leziuni definite. Testul cometei este utilizat pentru a urmări acumularea de pauze ADN (intermediari de reparare) cu timpul de incubație. Recent, Slyskova și colegii au fost primii care au aplicat cu succes testele de reparare a ADN-ului in vitro pentru BER și NER pe probe de țesut uman; în mod specific, biopsii de carcinom colorectal (Slyskova și colab., 2012, 2014).

un alt tip de test de reparare a ADN-ului, care permite celulelor încorporate în gel să se repare înainte de liză, a fost adoptat recent pentru a studia cinetica reparării ADN-ului mai detaliat; mai exact, pentru a studia reglarea proteinelor BER prin modificări post-transcripționale (Nickson și Parsons, 2014). Cu toate acestea, un alt mod de a studia repararea ADN-ului, la nivelul genelor specifice, este cu tehnica comet-FISH, care folosește sonde ADN marcate fluorescent care vor hibridiza la ADN-ul monocatenar din coada cometei. McAllister și colab. (2014) a folosit această metodă pentru a studia repararea preferențială a ruperii firelor în ADN-ul în vrac, precum și în regiunile selectate cu gene transcrise activ.

studierea cineticii reparării daunelor induse ne va ajuta să înțelegem răspunsurile celulare la substanțele chimice genotoxice. Mai mult, semnificația reparării ADN-ului ca jucător în procesul (anti)carcinogen poate fi elucidată prin analizarea reparației la nivelul țesuturilor țintă specifice cancerului. Reglarea reparației—și alte aspecte ale răspunsului celular la compușii genotoxici—este probabil să implice mecanisme epigenetice, iar testul comet a fost adoptat cu succes pentru a măsura modificările modelului global de metilare a ADN-ului în celulele individuale în diferite condiții de creștere (Lewies și colab., 2014).

procentul de ADN din coadă este recomandat ca cel mai bun descriptor pentru frecvențele de rupere a ADN—ului, deoarece cometele la care se face referire—și amploarea daunelor-pot fi vizualizate cu ușurință. Cu toate acestea, mulți cercetători preferă în continuare utilizarea momentului cozii (m Electicller și colab., 2014). De fapt, cei doi descriptori sunt influențați în mod similar de condițiile de testare (Azqueta și colab., 2011; Ersson și m Uniftller, 2011).

variabilitatea testului cometei este o problemă importantă, indiferent dacă apare din utilizarea diferitelor protocoale sau din variația experimentală incontrolabilă sau aleatorie. Se recomandă includerea standardelor de referință în toate experimentele, mai ales atunci când un număr mare de probe—de exemplu, dintr—un studiu de biomonitorizare-sunt analizate în diferite ocazii. Standardele de referință sunt celule cu o cantitate cunoscută de deteriorare a ADN-ului; fie celule netratate (martor negativ), celule expuse la raze X (control pozitiv), fie celule tratate cu fotosensibilizator plus lumină (control pozitiv pentru teste inclusiv incubarea FPG), preparate în serie și congelate sub formă de alicote. Dacă apare o variație substanțială a standardelor într-o serie de experimente, rezultatele eșantionului pot fi normalizate (Collins și colab., 2014). Dacă se schimbă standarde de referință între laboratoare, rezultatele acestor laboratoare pot fi comparate mai ușor.

celulele standard de referință sunt setate în mod normal în geluri în paralel cu gelurile de probă. Standarde interne—i. e., celule standard în același gel ca și celulele de probă-ar fi ideal; dar este, desigur, esențial să se poată distinge cele două tipuri de celule. Celulele de pește care sunt fie mai mari, fie mai mici în dimensiunea genomului în comparație cu celulele umane au fost adoptate cu succes în acest scop (Brunborg și colab., 2015). Aceste celule de referință pot fi utilizate în combinație cu o curbă standard sau de calibrare (stabilită cu celule cărora li se administrează doze diferite de radiații ionizante), permițând o cuantificare mai precisă a leziunilor ADN exprimate ca frecvență de rupere a ADN-ului, mai degrabă decât % ADN coadă.

Statisticile sunt un instrument important în toate aplicațiile testului cometei, pentru a verifica dacă diferențele mici apar întâmplător. Au fost publicate descrieri Concise ale analizei statistice și recomandări pentru teste (Lovell și colab., 1999; Lovell și Omori, 2008). M okticller și Loft (2014) ne reamintesc că, pentru a menține analiza statistică a testului cometei, proiectarea simplă a studiului adecvat și puterea statistică ar trebui luate în considerare cu atenție la planificarea experimentelor.

ca și în cazul tuturor testelor biologice, integrarea datelor este crucială pentru interpretarea rezultatelor testului cometei în imaginea de ansamblu. Integrarea informațiilor furnizate de testul comet cu alți indicatori de deteriorare a ADN-ului și răspunsuri celulare (de exemplu, stresul oxidativ, diviziunea celulară sau moartea celulară) a fost aplicată atât în ERA (Costa și colab., 2014; Santos și colab., 2015), precum și studii umane (biomonitorizare) (de exemplu, Langie și colab., 2010; Slyskova și colab., 2012). De asemenea, includerea datelor “omics” va ajuta la dezvăluirea modului de acțiune al compușilor genotoxici (Slyskova și colab., 2012, 2014; Santos și colab., 2015) – deși merită subliniat faptul că mai multe studii au arătat că măsurile fenotipice de reparare a ADN-ului nu se corelează neapărat cu datele genomice sau transcriptomice (Collins și colab., 2012; Slyskova și colab., 2012, 2014); diferitele abordări ar trebui considerate complementare.

chiar și după trei decenii de dezvoltare și modificare, testul comet este încă un test destul de simplu, versatil, dar intensiv în muncă. Au fost revizuite recent diverse modificări de mare capacitate ale testului (Brunborg și colab., 2014). Atât aplicațiile in vivo, cât și cele in vitro ar obține un mare avantaj din îmbunătățirile ulterioare ale eficienței, standardizării protocolului și tranzitului. Automatizarea și miniaturizarea sunt strategii comune în multe domenii ale biologiei, permițând modificări ale ordinelor de mărime ale numărului de probe analizate pe experiment, reducând părtinirea subiectivă și sporind reproductibilitatea.

Deci—ce putem spera în următorii 30 de ani? Acceptarea testului in vitro comet pentru testarea genotoxicității, scorarea automată ieftină a cometelor pentru a salva cercetătorii de la vizualizarea interminabilă a microscopului, standardizarea protocolului (probabil) și standardele de referință interne fiabile, mai multe studii de biomonitorizare umană a reparării ADN-ului (acceptând că testele fenotipice au un loc important alături de Genomică și transcriptomică), monitorizarea mediului folosind o varietate de specii de animale și plante; și multe evoluții și aplicații mai imprevizibile.

Declarație privind conflictul de interese

autorii declară că cercetarea a fost realizată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

mulțumiri

dorim să mulțumim tuturor autorilor, precum și recenzorilor și editorilor care au contribuit la acest subiect de cercetare Frontiers. SL este beneficiarul unui grant post-doctoral din partea AXA Research Fund și CEFIC-LRI Innovative Science Award 2013. AA mulțumește Ministerio de Economy aktiva y Competitividad (programul Ram Aktivn y Cajal, 2013) al guvernului spaniol pentru sprijin personal.