mutanți promotori CMV cu tendință redusă la pierderea productivității în celulele CHO

pentru a monitoriza efectele situsurilor CpG predispuse la metilare din regiunea potențiator, proximal și promotor de bază, am ales să investigăm nu numai C-179, ci și citozinele la pozițiile -508 (C-508) și -41 (c-41). Niciunul dintre siturile CpG selectate nu se suprapune cu siturile cunoscute de legare a factorului de transcripție la speciile Cricetidae. Pentru a menține conținutul general de GC, s-au efectuat traversări de la C la G (Fig. 1a). Pe lângă C-41, C-13 este a doua citozină din regiunea promotorului de bază care pare a fi frecvent metilată. Deoarece mutația C-13 la G ar crea un nou site CpG, am preferat să investigăm c-41g. variantele promotorului mutant au fost abreviate cu un cod de trei litere, de exemplu, varianta GCC are guanină în loc de citozină în poziția -508, în timp ce bazele citozinei la -179 și -41 sunt păstrate. CCC este controlul nemutat hCMV-MIE (Fig. 1a). Promotorii mutanți sau nativi au fost introduși în diferite plasmide și plasați în amonte de diferite gene reporter.

pentru a vedea dacă mutațiile afectează puterea promotorului, am efectuat două experimente independente prin transfectarea tranzitorie a plasmidelor reporter care exprimă fosfataza alcalină embrionară secretată (SEAP) în celulele CHO-K1 și am examinat expresia SEAP la cinci zile după transfecție. Promotorul nemutatizat a fost folosit ca referință (Fig. 1b). Expresia SEAP de la promotorii GGG, GCG și CGC a fost constant cu aproximativ 20% mai mică decât de la promotorul nemutatizat, cu variații minore între experimentele replicate. În general, mutațiile de la C la G au prezentat o tendință de reducere modestă a rezistenței promotorului, care, totuși, părea acceptabilă.

în continuare, am întrebat dacă variantele promotorului hCMV-MIE influențează stabilitatea expresiei celulelor CHO transfectate permanent în timpul cultivării pe termen lung. În acest scop, am ales un reporter eGFP care permite analiza citometrică a expresiei genelor reporter la nivel unicelular. plasmidele reporter eGFP au fost transfectate în celule CHO-K1 și trei până la patru bazine independente de celule transfectate permanent au fost selectate cu metotrexat (MTX). Acestea au fost cultivate pe parcursul a trei luni în prezența agentului de selecție MTX. Treizeci și patru și optzeci și șapte de zile după transfecție, expresia eGFP a fost măsurată prin citometrie (două bazine s-au pierdut între ziua 34 și 87 din cauza contaminării). Mijloacele geometrice ale intensității fluorescenței de 10.000 de evenimente pe măsurare au fost calculate pentru fiecare grup de celule și reprezentate grafic pentru ambele puncte de timp (Fig. 1c). Treizeci și patru de zile după transfecție, a existat o mică diferență între construcții. Doar o singură piscină CGC a prezentat niveluri ridicate de Expresie. Optzeci și șapte de zile după transfecție, două din patru bazine transfectate cu CGC și două din trei bazine transfectate cu CCG au afișat valori eGFP distinct mai mari decât toate celelalte bazine, transfectate fie cu controlul nemutat, fie cu variantele promotor rămase. Aceste observații au sugerat un efect stabilizator al mutațiilor unice C-41g sau C-179g asupra expresiei eGFP. Pentru a consolida acest rezultat, am repetat experimentul atât cu variante promotor, cât și cu un număr mai mare de bazine. Am generat zece bazine cu CCG sau CCC, respectiv opt bazine cu CGC (două bazine s-au pierdut din cauza contaminării). Celulele au fost cultivate ca înainte și analizate prin citometrie în flux din ziua 42 până în ziua 69 după transfecție (Fig. 1D și suplimentar Fig. S1 online). După 42 de zile, expresia eGFP a fost puternic crescută în patru bazine CCG comparativ cu grupurile de control CCC, în timp ce două bazine CGC au demonstrat o creștere moderată a expresiei eGFP (Fig. 1D, panoul din stânga). După 69 de zile, trei bazine CCG au prezentat încă niveluri ridicate de eGFP, în timp ce expresia eGFP a bazinelor CGC a scăzut la nivelurile de control CCC (Fig. 1D, panoul din dreapta). Diferențele dintre grupuri au fost testate la fiecare punct de timp cu testul non-parametric Steel-Dwass. Nivelul alfa a fost setat la 0,05. O diferență semnificativă a fost observată între CCG și CCC în ziua 56 după transfecție (p = 0,0305; Vezi Fig suplimentar. S1 online). Luate împreună, rezultatele din Fig. 1c, d a sugerat că ambele mutații C-41g și C-179g pot întârzia pierderea expresiei genei recombinante conduse de hCMV-MIE.

mutațiile C-41g și C-179g inhibă complet metilarea ADN-ului la locul respectiv, deoarece guanina nu poate fi metilată. Ne-am întrebat dacă aceste mutații au afectat și nivelurile de metilare la alte site-uri CpG din cadrul hCMV-MIE. Prin urmare, am măsurat nivelurile de metilare ale tuturor siturilor CpG în variantele individuale hCMV-MIE prin conversia bisulfitului cuplată cu secvențierea de generație următoare. În acest scop, am extras ADN genomic din bazinele celulare ale celui de-al doilea experiment la 42 și 69 de zile după transfecție și l-am tratat cu bisulfit pentru a discrimina între citozina metilată și cea nemetilată. ADN-ul hCMV-MIE a fost amplificat și secvențiat cu sistemul Illumina MiSeq (Fig. 1e). C-179 a fost cel mai puternic metilat în toate bazinele transfectate fie cu CCC, fie cu CCG, confirmând observațiile anterioare cu hCMV-MIE12 nemutat. Mai mult, am observat un model distinct de metilare care a fost foarte similar cu toate bazinele, dar a diferit în intensitatea generală. În special, C-508 și C-41 nemutate au fost în mod constant printre cele mai frecvent situsuri metilate. Mutația C-41 în varianta promotor CCG, în special mutația C-179 în varianta CGC, par să scadă uniform metilarea tuturor siturilor CpG, mai degrabă decât să schimbe modelul de metilare. Când am calculat nivelurile medii de metilare în toate siturile CpG pentru fiecare grup, am detectat o metilare globală mai mică cu variantele promotorului mutant (vezi Fig suplimentar. S2 online). Diferența a fost cea mai pronunțată cu varianta CGC, dar nu a atins semnificația statistică cu testul Steel-Dwass (0,05). În medie, metilarea a crescut în timp cu toate construcțiile.

pe lângă reducerea la tăcere a promotorului epigenetic, pierderea copiilor transgene este o cauză majoră a instabilității producției în celulele recombinante20. Pentru a estima contribuția relativă, am măsurat numerele de copii plasmidice prin qPCR la 42 și 69 de zile după transfecție. Numărul mediu de copii plasmidice a scăzut în timp, fără nicio diferență evidentă între constructe (vezi Fig. S2 online). Interesant este că distribuția numerelor de copii a fost mutată către valori mai mici în grupul CGC. Cu toate acestea, atunci când am testat semnificația statistică cu testul Steel-Dwass, diferențele dintre constructe nu s-au dovedit a fi semnificative (0,05).

bazinele de celule transfectate permanent sunt amestecuri foarte eterogene de clone care diferă în expresia transgenă și rata de creștere. Clonele foarte productive tind să aibă o rată de creștere mai mică21. Prin urmare, celulele cu producție scăzută, dintre care multe sunt prezente în cultură după transfecție, aproape inevitabil depășesc producătorii înalți mai devreme sau mai târziu. Pentru a minimiza această prejudecată, am investigat mutațiile C-179g și C-41g în liniile celulare clonale. Deoarece ne-am propus să evaluăm efectele asupra producției unui potențial produs comercial, am trecut la o proteină de fuziune IgG-IL2 ca reporter. Astfel, variantele promotor care conțin ambele mutații fie singure (CGC sau CCG), fie în combinație (CGG) au fost inserate în amonte de lanțul ușor și gena lanțului greu a unei plasmide de Expresie IgG-IL2.

plasmidele de Expresie care transportă fie CCG, CGC, CGG, fie hcmv-MIE nemutate au fost transfectate în celule CHO-K1 și clonele transfectate Stabil Au fost izolate în plăci cu 384 de puțuri. Treizeci de linii celulare clonale pe construct au fost selectate aleatoriu și extinse în plăci cu șase puțuri. După ce liniile celulare au arătat o creștere stabilă, am studiat productivitatea lor timp de aproximativ două luni, din ziua 68 până în ziua 134 după transfecție. Unele linii celulare s-au pierdut din cauza contaminării sau a viabilității reduse, totuși 23 până la 29 de clone pe construct au fost examinate pe întreaga perioadă de timp.

pe parcursul întregului studiu am determinat concentrațiile de IgG-IL2 în supernatanții pe culturi celulare și productivitatea pe celulă și zi (Productivitate specifică qP). La începutul (ziua 68) și la sfârșitul (ziua 134) a studiului, liniile celulare transfectate cu CGC au prezentat titruri semnificativ mai mari decât transfectanții de control (XV = 0,05; Fig. 2a). Liniile celulare cu titruri remarcabil de mari au fost, de asemenea, observate la transfectanții CGG în ziua 68 și la transfectanții CCG și CGG în ziua 134. Când am comparat productivități specifice între liniile celulare transfectate cu diferite construcții, am făcut observații similare (Fig. 2b). Pentru a compensa imprecizia în numărarea celulelor, am făcut o medie a productivităților specifice qP a două pasaje la început (ziua 68-71 și 83-86 după transfecție reprezentând primele puncte de date disponibile) și a trei pasaje la sfârșitul cultivării pe termen lung (ziua 124-127, ziua 127-131 și ziua 131-134 după transfecție). Diferențe semnificative între liniile celulare transfectate cu CGC sau CCC au fost observate la sfârșitul cultivării pe termen lung (0,05).

variantele hCMV-MIE CGC și CCG stabilizează producția de proteine recombinante în liniile celulare clonale CHO.

(a) titrurile IgG-IL2 ale clonelor CHO la 68 de zile (panoul din stânga) și la 134 de zile (panoul din dreapta) după transfecție. (b) productivitatea specifică qP a clonelor CHO la începutul (panoul din stânga) și la sfârșitul (panoul din dreapta) cultivării pe termen lung. Valorile qP timpurii au fost calculate prin medierea valorilor qP a două pasaje timpurii reprezentând cele două puncte de date timpurii (zilele 68-71 și zilele 83-86 după transfecție). Valorile tardive ale qP au fost calculate prin medierea ultimelor trei pasaje (zilele 124-127, zilele 127-131 și zilele 131-134 după transfecție) (c) modificarea procentuală a productivităților specifice în timpul cultivării pe termen lung pe baza datelor prezentate în (b) cu (panoul din stânga) și fără (panoul din dreapta) un outlier identificat prin analiza jackknife. Au fost luate în considerare numai clonele care produc niveluri detectabile de produs în ziua 68. (a–c) identitatea variantelor promotor și numărul (N) de grupuri de celule independente sunt indicate sub axa X. Capetele superioare și inferioare ale cutiilor reprezintă prima și a treia quartilă a fiecărui grup. Capetele mustăților reprezintă cele mai mici și cele mai mari valori încă în intervalul interquartil de 1,5 ori. Linia gri indică media generală a variabilei y din diagramă. Diferențele semnificative (0,05) între grupe în funcție de testul oțel-Dwass sunt indicate de valorile P.

titrurile mai mari și productivitățile specifice ale liniilor celulare purtătoare de G-179 sau g-41 au sugerat un efect stabilizator al acestor mutații asupra expresiei genei determinate de hCMV-MIE. Pentru a documenta acest efect, am calculat modificarea procentuală a qP în timpul cultivării pe termen lung pentru fiecare linie celulară individuală ca fiind cea mai potrivită măsură a stabilității sale de producție (Fig. 2c). Desigur, acest lucru a fost posibil numai cu liniile celulare care produc încă IgG-IL2 în ziua 68 după transfecție. Un transfectant de control și-a crescut productivitatea specifică cu 500% și a fost identificat ca outlier prin analiza jackknife outlier (Fig. 2C, complot stânga). Prin urmare, această linie celulară a fost exclusă din analiza ulterioară (Fig. 2C, complot dreapta). Liniile celulare transfectate fie cu CGC, fie cu CCG au fost semnificativ mai stabile decât liniile celulare de control transfectate cu CCC (0,05). În mod surprinzător, mutantul dublu CGG nu a fost diferit de control.