Testul de eliberare a cromului: modul vechi de testare a celulelor T citotoxice

există mai multe metode pe care le puteți utiliza pentru a vedea dacă celulele T sunt citotoxice, dar un test de eliberare a cromului folosind 51chromium radioactiv (51cr) este unul dintre cele mai vechi. Acesta oferă rezultate bune, și este mare pentru laboratoare care nu își pot permite sau nu au citometrie în flux disponibile.

aici, voi sublinia o metodă simplă pentru testarea funcției de ucidere a celulelor T folosind 51Cr. Dar înainte de a începe testul, asigurați-vă că citiți măsurile de siguranță adecvate atunci când manipulați materiale radioactive.

alegeți ținta și efectorii

pentru a efectua un test de eliberare a cromului, mai întâi incubați celulele țintă (T) cu 51Cr. Apoi incubați celulele țintă cu celule efectoare (celulele T; E). Dacă celulele efectoare ucid țintele, atunci vor elibera 51cr, pe care îl veți detecta cu un contor gamma.

ce ținte și efectori utilizați depinde în întregime de aplicația dvs. Celulele dvs. țintă sunt ceea ce testați funcția celulelor T împotriva. S-ar putea să doriți să vă ucideți ținta (măsurați citotoxicitatea) sau ați putea căuta să vedeți dacă celulele T sunt tolerante (cum ar fi testarea celulelor fabricate înainte de a intra într-un pacient pentru siguranță!). Celulele T efectoare pot fi, de asemenea, derivate din diferite surse. De exemplu, puteți utiliza linii de celule T fabricate sau celule T proaspăt izolate de la un animal.

să fim radioactivi

odată ce v-ați adunat țintele și efectorii, este timpul să vă pregătiți.

1. numără-ți celulele. Puteți utiliza un hemocitometru sau un contor automat de celule. Numărul de celule de care aveți nevoie depinde de numărul de condiții și de câte replici ale fiecărei condiții Faceți. De obicei, îmi rulez testele în trei exemplare și am patru rapoarte (5:1, 10:1, 20:1 și 40: 1 E: T). Alicotați celulele țintă (în cazul meu 500.000 – aproximativ 25.000 pe godeu) în tuburi conice de 15 ml, păstrând fiecare condiție experimentală separată! Asigurați-vă că vă suspendați celulele într-un volum mic, astfel încât acestea să aibă șansa de a intra în contact cu cromul.

1. adăugați 51cr (în jur de 50 de centicci) și incubați țintele cu crom timp de o oră. Scuturați tuburile la fiecare 20 de minute pentru a crește oportunitățile pentru celule de a absorbi cromul.

1. în timp ce incubați….Această incubație lungă este un moment minunat pentru a vă configura celulele efectoare. Spălați celulele T de două ori cu PBS pentru a elimina excesul de citokine care ar putea distorsiona rezultatele. Apoi omogenizați-le în suportul corespunzător.

1. după ce ați terminat spălările, sunteți gata să vă puneți efectorii pe farfurie! Eu folosesc de obicei o placă de 96 bine, deoarece volumele sunt destul de mici. Placați efectorii în raporturi diferite cu țintele pentru a determina pragul de ucidere. De obicei, rulez testul în triplicate, dar depinde de câte celule aveți la dispoziție. Raporturile 40, 20, 10 și 5 la 1 (efectori la ținte) sunt un șablon bun dacă aveți suficiente celule disponibile.

în plus față de aceste teste, configurați două condiții de control:

• un control al eliberării spontane care conține doar celule țintă (practic un control negativ deoarece nu ar trebui să existe ucidere fără efectori) și
• un control al eliberării maxime în care lyse celulele țintă (un control pozitiv care arată cantitatea maximă de crom preluată de celule).

1. înapoi la acele celule țintă … odată ce celulele țintă sunt incubate, spălați-le de trei ori cu mediu de cultură celulară pentru a elimina excesul de crom. Rotiți ușor celulele la 400g timp de 5 min pentru fiecare dintre aceste spălări. Decantați supernatantul într-un recipient pentru deșeuri care poate fi transferat într-o zonă sigură de descompunere, mai degrabă decât să încercați să-l pipetați. Acest lucru va ajuta la reducerea posibilei contaminări, deoarece nu va trebui să vă ocupați de niciun sfat.

1. după spălări, omogenizați celulele la 5000 de celule la 100?l. apoi adăugați 100?l de celule la fiecare bine, chiar și puțurile spontane și maxime. Incubați celulele împreună timp de cel puțin 4 ore la 37 centimetric C, exact cât timp depinde de aplicația dumneavoastră.

1. patru ore mai târziu….Scoate farfuria din incubator. Adăugați 100?l dintr-o soluție de triton-x 1% pentru celulele dvs. în godeurile maxime pentru a Liza celulele și a elibera tot cromul.

1. rotiți placa în jos la 1250 rpm Timp de zece minute pentru a peleta celulele.

1. transferați supernatantul din fiecare godeu în godeul unei plăci absorbante (de exemplu plăci Luma) având grijă să nu atingeți peleta din partea inferioară a godeului.

1. lăsați placa să se usuce peste noapte. Dimineața, introduceți-l în cititorul de plăci și obțineți rezultatele.

rezultatele pe care le vedeți vor depinde de aplicația dvs. specifică

calcularea rezultatelor testului de eliberare a cromului

odată ce aveți citirile, trebuie să efectuați un calcul simplu pentru a determina citotoxicitatea celulelor.

în primul rând, media triplicate pentru fiecare condiție. Apoi luați aceste medii și conectați-le la această formulă:

(eliberarea cromului pentru starea de interes – eliberarea cromului în puțuri spontane)/ (eliberarea maximă a cromului – eliberarea cromului în puțuri spontane)

înmulțiți valoarea cu 100 pentru a obține Liza procentuală.