Stabilisierung von Heterochromatin durch CLOCK fördert Stammzellverjüngung und Knorpelregeneration

Antikörper

Für Western Blotting: Anti-CLOCK (#5157, 1:1.000), Anti-HP1a (#2616S, 1:1.000) und Anti-HP1y (#2619, 1: 3.000) von Cell Signaling Technology; Anti-KAP1 (Ab22553, 1:2.000), Anti-Lamin B1 (Ab16048, 1:1.000) und Anti-LBR (Ab32535, 1:1.000) von Abcam; Anti-β-Aktin (sc-69879, 1:3.000) von Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) von R&D-Systemen.

Für durchflusszytometrie: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 ( 560198, 1:200), Anti-CD45 (555482, 1:200), Anti-CD14 (555398, 1:200) und Anti-CD19 (555415, 1:200) von BD Biosciences; Anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) und Anti-PDPN (17-9381-42, 1:200) von eBioscience (San Diego, CA, USA); Anti-CD29 (303004, 1:200) und Anti-CD13 (301705, 1:200), anti-CD166 (343903, 1:200) und Anti-CD164 (324805, 1:200) von Biolegend (San Diego, CA, USA).

Zellkultur

CLOCK+/+ hESCs (hESCs, Linie H9, WiCell Research Institute) und CLOCK−/− hESCs wurden auf Feeder-Schichten gehalten, die aus Mitomycin C-inaktivierten mausembryonalen Fibroblasten (MEFs) in hESC-Kulturmedium bestanden. Das hESC-Kulturmedium enthielt DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut-Serumersatz (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM nichtessentielle Aminosäuren (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM β-Mercaptoethanol (Thermo Fisher Scientific), 1% Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) und 10 ng/ml bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea). Alternativ wurden hESCs auf Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)-beschichteten Platten in mTeSR-Medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) kultiviert.

Sowohl hESC-abgeleitete hMSCs als auch primäre hMSCs wurden in MSC-Medium gehalten, das MEMa (Thermo Fisher Scientific) enthielt, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (Cat # 10099-141, Lot # 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% Penicillin / Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) und 1 ng / ml bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

CRISPR / Cas9-vermittelte Geneditierung in hESCs

CRISPR / Cas9-vermittelte Geneditierung wurde über zuvor beschriebene Methoden mit einigen Modifikationen durchgeführt.33,34,65 In Kürze wurde eine auf Exon 5 von CLOCK (CLOCK-gRNA) gerichtete Guide-RNA in einen gRNA-Klonierungsvektor (#41824, Addgene) kloniert (Zusatzinformation, Tabelle S1). Nach 24 h Behandlung mit einem ROCK-Inhibitor Y-27632 (S1049, Selleck) wurden hESCs (5 × 106) in 100 µL Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific), enthaltend den Plasmidcocktail, der aus dem die Homologiearme CLOCK-gRNA und hCas9 (#41815, Addgene) enthaltenden Donorplasmid bestand, resuspendiert und in einem 4D-Nukleofektorsystem (Lonza) elektroporiert. Die Zellen wurden dann auf MEF-Feeder-Zellen ausgesät. G418 (100 µg / ml, 11811023, Thermo Fisher Scientific) wurde hinzugefügt, um die positive Selektion 2-4 Tage nach der Elektroporation zu initiieren. Nach 2 Wochen Selektion wurden G418-resistente Klone gepflückt und zur weiteren Charakterisierung und Expansion auf eine 96-Well-Platte übertragen. Genomische PCR und Western Blotting wurden zur Identifizierung der genomischen Bearbeitung verwendet. Zusätzlich entfernten wir die Neomycin-Resistenzkassette in CLOCK−/− hESCs durch Elektroporation mit dem PCAG-FLpo-2A-puro-Vektor. Drei Tage nach der Transfektion wurde 1 µg / ml Puromycin (Thermo Fisher Scientific) verwendet, um Puromycin-resistente Zellen für 48 h anzureichern. Nach 8-12 Tagen Selektion wurden die entstehenden Kolonien gepflückt und für die nachfolgende Untersuchung erweitert.

hMSC-Erzeugung und -Charakterisierung

hMSCs wurden nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll von hESCs unterschieden.25,86,87 Kurz gesagt, hESCs wurden in embryoide Körper (EBs) dissoziiert und mit Differenzierungsmedium behandelt (MEMa (Invitrogen) supplementiert mit 10% FBS (Cat# 10099-141, Lot#1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1mM NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/ml bFGF, 5 ng/ml TGFß und 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco)) auf matrigelbeschichteten Platten für 10 Tage bis 95% Konfluenz. Als nächstes wurden die konfluenten MSC-ähnlichen Zellen verdaut und auf matrigelbeschichteten Platten plattiert, die mit MSC-Kulturmedium behandelt wurden, das MEMa (Invitrogen) enthielt, ergänzt mit 10% FBS, 0,1 mM NEAAs, 1 ng / ml bFGF und 1% Penicillin / Streptomycin (Gibco). Dann wurden die konfluenten MSC-ähnlichen Zellen auf gelatinebeschichtete Platten passagiert. Die hMSCs wurden mit verschiedenen Antikörpern, die hMSC-spezifischen Markern (CD73, CD90 und CD105) entsprechen, durch FACS gereinigt. Die dreifach positiven CD73-, CD90- und CD105-Zellen wurden ferner durch Oberflächenantigen-Marker charakterisiert, einschließlich positiver Marker, wie CD44, CD166, CD29, HLA-ABC und CD13, und negativer Marker, wie CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 und PDPN. Die Funktionalität von hMSCs wurde durch Differenzierung in Richtung Chondrozyten, Adipozyten und Osteoblasten weiter verifiziert. Die von hMSCs abgeleiteten Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten wurden durch von-Kossa-Färbung (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc.(T3260, Sigma) und Aggrecan-Färbung (Anzeige der Chondrogenese) und Ölrot O (O1391, Sigma) Färbung (Anzeige der Adipogenese) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Isolierung und Kultur von primären hMSCs

Primäre hMSCs wurden aus der Gingiva verschiedener Individuen isoliert.23,33,34,65 Die von der Gingiva abgetrennten Gewebe wurden mit einer Schere in TrypLE™ Express Enzym (1 ×) plus Dispase IV in kleine (1 mm2) Stücke geschnitten und 30 min bei 37 ° C weiter inkubiert. Die aufgeschlossenen Gewebesuspensionen wurden durch MSC-Kulturmedium neutralisiert und bei 200×g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden in MSC-Kulturmedium, das MEMa (Invitrogen) enthielt, das mit 10% FBS (Gibco), 1 ng / ml bFGF und 1% Penicillin / Streptomycin (Gibco) ergänzt wurde, resuspendiert und auf gelatinebeschichtete Platten für das Wachstum von primären hMSCs plattiert.

Luciferase Reporter Assay

Das PER2-dLuc Plasmid war ein freundliches Geschenk von E.E. Zhang.88 Zellen, die PER2-dLuc beherbergen, wurden in 24-Well-Kulturplatten bis zur Konfluenz gezüchtet und mit 20 µM Forskolin (S2449, Selleck) für 2 h synchronisiert. Das Medium wurde dann durch ein Kulturmedium ersetzt, das 0,25 mM Luciferin (LUCK-1G, GoldBio) enthielt. Die Zellen wurden in einem LumiCycle Luminometer bei 37 °C für 5-7 Tage überwacht; Die erzeugten Daten wurden mit der LumiCycle Analysesoftware (Actimetrics) analysiert. Die Daten aus dem ersten 24-Stunden-Zyklus wurden von unserer statistischen Analyse ausgeschlossen.

In vitro hMSC-Synchronisation und circadiane Analyse

hMSCs wurden auf gelatinebeschichteten Platten mit MSC-Medium bis zu 95% Konfluenz plattiert. Zur Synchronisation wurden die Zellen dann 2 h mit 20 µM Forskolin behandelt und nach zweimaligem Waschen mit PBS in MSC-Medium wieder gelagert. Die Zellen wurden ab 24 h Nachsynchronisation in 3-h-Intervallen für 9 Zeitpunkte gesammelt, gefolgt von RNA-Extraktion und RT-qPCR-Nachweis. Der nichtparametrische Test JTK_CYCLE wurde zur Verifizierung von circadianen Oszillationen wie zuvor beschrieben verwendet.89 Zeitverlaufstränge von hMSCs mit p- und q-Werten < 0,05 wurden als rhythmisch betrachtet.

Western Blotting

Die Zellen wurden in SDS-Puffer mit 4% SDS und 100 Mm Tris-HCl lysiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Quantifizierungskit (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert, und ~ 20 µg Protein pro Probe wurden einer SDS-PAGE unterzogen und auf PVDF-Membranen (Millipore) elektrotransferiert. Dann wurden Membranen mit 5% iger Milch blockiert und mit primären Antikörpern und dann mit Meerrettichperoxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Immunreaktive Banden wurden in einem ChemiDoc XRS+ System (Bio-Rad) visualisiert. Statistische Analysen wurden von Image J Software (NIH) quantifiziert. Jede Gruppe hatte drei unabhängige Experimente. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet.

Transmissionselektronenmikroskopie

Late-Passage (P9) CLOCK+/+ und CLOCK−/− hMSCs wurden enzymatisch mit TrypLE (Thermo Fisher Scientific) geerntet und bei 500×g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets wurden mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (pH 7,4) über Nacht auf Eis fixiert. Die Zellen wurden anschließend in einer abgestuften Reihe von Ethanolen dehydriert, permeabilisiert und in Lowicrylharz HM20 eingebettet. Schnitte (200 nm) wurden erhalten und mit einem Spirit-Transmissionselektronenmikroskop (Firma FEI) bei 100 kV abgebildet.

Immunfluoreszenzfärbung

Auf Deckgläser (Thermo Fisher Scientific) ausgesäte Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 4% PFA für 30 min fixiert, mit 0,4% Triton X-100 in PBS für 30 min permeabilisiert und mit 10% Eselsserum in PBS (Jackson Immuno Research) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Nach der Blockierung wurden die Zellen über Nacht bei 4°C mit primären Antikörpern inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, 1 h bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen. Kerne wurden mit Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific) angefärbt. Die Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Leica SP5-System. Die statistische Analyse der Anzahl, Intensität und Fläche von Fluoreszenzsignalen wurde von Image J Software (NIH) quantifiziert. Die Zellen wurden aus drei biologischen Replikaten gesammelt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet. Die 3D-Rekonstruktion der H3K9me3-Färbung gemäß Fig. 2f wurde durch serielles Z-Stack-Schneiden in 50-nm-Intervallen in einem konventionellen Modus für bis zu 50 Bilder mit einem konfokalen Leica SP5-System durchgeführt und für die 3D-Rekonstruktion mit der Imaris-Software (Version 7.4.2) wie zuvor beschrieben weiterverarbeitet.90

SA-β-gal-Färbetest

Die SA-β-gal-Färbung wurde wie in früheren Studien beschrieben durchgeführt.33,34 In Kürze, Zellen wurden mit Fixierpuffer fixiert (2% Formaldehyd und 0.2% Glutaraldehyd) für 5 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurden fixierte Zellen mit frischer Färbelösung bei 37°C über Nacht angefärbt. In jeder Vertiefung wurden zufällig Sichtfelder ausgewählt, und der Prozentsatz der SA-β-gal-positiven Zellen wurde unter Verwendung der ImageJ-Software bestimmt. Jede Gruppe hatte drei biologische Replikate. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet.

Klonexpansionstest

Wie bereits berichtet, wurde ein Klonexpansionstest durchgeführt.34,65 Kurz gesagt, 6000 Zellen pro Well wurden in 6-Well-Platten ausgesät und für 9-12 Tage kultiviert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, mit 4% PFA fixiert und 1 h bei Raumtemperatur mit 0,2% Kristallviolett gefärbt. Die Sichtfelder wurden mit einem Scanner gescannt und mit der ImageJ-Software (NIH) weiter gemessen. Jede Gruppe hatte drei biologische Replikate. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet.

Co-IP

HEK293T-Zellen, transfiziert mit Plasmiden, die Flag-Luc oder Flag-CLOCK exprimieren, und hMSCs wurden in CHAPS-Lysepuffer (120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5) und complete protease inhibitor Cocktail (Roche)) bei 4°C für 4 h und wurden dann bei 14.500×g bei 4°C für 40 min zentrifugiert. Für Co-IP mit exogenen Proteinen wurden die Überstände mit Anti-Flag Antikörper-gekoppelten Beads (A2220, Sigma) gemischt und über Nacht bei 4°C rotiert. Für Co-IP mit endogenen Proteinen wurden die Überstände mit den angegebenen Antikörpern über Nacht bei 4°C unter Rotation gemischt und anschließend mit Protein A/G-PLUS Agarose Beads (sc-2003, Santa Cruz) für weitere 4 h bei 4°C unter Rotation inkubiert. Die Beads wurden sechsmal mit CHAPS-Puffer gewaschen und anschließend mit Flag-Peptiden eluiert oder durch Kochen in 1× SDS-Beladungspuffer für 10 min für Western-Blotting.

LC-MS/MS-Analyse und Proteinidentifikation

Die durch Immunpräzipitation erhaltenen eluierten Proteine wurden einer 10%igen SDS-PAGE unterzogen und mit Coomassie brilliant blue (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Die die Proteinproben enthaltenden Gelbanden wurden exzidiert, in kleine Pfropfen geschnitten, dehydratisiert (100% Acetonitril), reduziert (10 mM DTT in 25 mM NH4HCO3 für 45 min bei 56°C) und alkyliert (40 mM Jodacetamid in 25 mM NH4HCO3 für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln). Anschließend wurden die Gelpfropfen getrocknet und mit sequenzierfähigem modifiziertem Trypsin (40 ng pro Bande) in 25 mM NH4HCO3 über Nacht bei 37°C digeriert. Schließlich wurde Ameisensäure bis zu einer Endkonzentration von 1% verwendet, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Die resultierende Lösung wurde dann zur LC-MS/MS-Analyse in ein Probenfläschchen überführt.

Die nanoLC-MS / MS-Experimente wurden an einem Q Exactive-Massenspektrometer (Thermo Scientific) im datenabhängigen Modus durchgeführt, der eine MS-Datenerfassung mit einer hohen Auflösung von 70.000 (m / z 200) über einen m / z-Bereich von 300-1.600 ermöglichte. Die Rohdaten von Q Exactive Analysis wurden mit Proteome Discovery (Version 1.4) unter Verwendung der Sequestrierungssuchmaschine zur Proteinidentifikation und des Perkolators zur Analyse der False Discovery Rate (FDR) analysiert. Die Daten wurden mit der UniProt Human Protein Database (aktualisiert am 06-2013) abgeglichen. Die FDR-Analyse wurde mit Perkolator durchgeführt, und FDR < 1% wurde als Schwelle für die Proteinidentifikation festgelegt. Die Peptidkonfidenz wurde für die Peptidfilterung auf hoch eingestellt.

RT-qPCR und RNA-Seq

Die Gesamt-RNA wurde aus kultivierten menschlichen Zellen oder Mausgelenken mit TRIzol (Thermo Fisher Scientific) extrahiert und die genomische DNA mit einem DNA-freien Kit (Thermo Fisher Scientific) entfernt. cDNA wurde mit dem Go Script Reverse Transkription System (Promega) erzeugt. RT-qPCR wurde unter Verwendung von qPCR Mix (Toyobo) in einem CFX384-Echtzeitsystem (Bio-Rad) durchgeführt. Jede Gruppe hatte vier gut repliziert. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet. Alle RT-qPCR-Experimente wurden mit mindestens drei experimentellen Replikaten durchgeführt und unabhängig voneinander mindestens zweimal wiederholt. Für Mausgelenk-RNA-seq wurden Kniegelenk-RNA-Proben aus derselben Behandlungsgruppe von gealterten Mäusen, denen Lentiviren injiziert wurden, die Luc (n = 12 Mäuse) oder CLOCK (n = 12 Mäuse) exprimierten, gleichmäßig in der Masse gemischt, und RNA-seq wurde mit zwei technischen Replikaten durchgeführt. Für hMSC RNA-seq wurden zwei biologische Replikate untersucht. Eine Sequenzierungsbibliothek wurde unter Verwendung eines NEBNext Ultra RNA Library Prep Kits für Illumina gemäß dem Herstellerprotokoll erstellt. Die generierten Bibliotheken wurden auf Illumina HiSeq X-Ten-Plattformen mit Paired-End-Sequenzierung mit 150-bp-Leselängen sequenziert. Qualitätskontrolle und Sequenzierung wurden von NoVo gene Bioinformatics Technology durchgeführt. Die für die qPCR verwendeten Primer sind in der Zusatzinformation Tabelle S2 aufgeführt.

RNA-seq-Datenverarbeitung

Die RNA-seq-Datenverarbeitungspipeline wurde bereits berichtet.34 Rohe Lesevorgänge am gepaarten Ende wurden in der Trim Galore-Software (Version 0.4.5) getrimmt (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Saubere Lesevorgänge wurden mit hisat2 (Version 2.0.4) auf das humane hg19-Genom der UCSC oder das mm10-Genom der Maus abgebildet.91 Die sam-Dateien wurden von SAMtools mit dem Parameter “-S -b -q 10” in bam-Dateien konvertiert.92 Dann wurden Lesezählungen von HTSeq (Version 0.11.0) berechnet, und nur hochwertige zugeordnete Lesevorgänge (Zuordnungsqualität > 20) wurden beibehalten.93 Der Wert der Fragmente pro Kilobase pro Million (FPKM) für jedes Gen wurde mit StringTie (Version 1.2.3) berechnet.94 Differentiell exprimierte Gene (DEGs) wurden unter Verwendung des DESeq2-Pakets (Version 1.22.2) mit dem Cutoff “q-Wert (angepasster p-Wert, padj) < 0,05 und | log2 (fold change) | > 1 für hMSCs oder | log2 (fold change) | > 0,5 für Mausgelenke” berechnet. Die Anreicherungsanalyse der Genontologie (GO) wurde mit ToppGene durchgeführt.Die 95-Gensatzanreicherungsanalyse wurde von GSEA (Version 2.2.4) durchgeführt. Der SASP-Gensatz wurde aus einer früheren Studie erhalten.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam und pLgw EcoDam-V5-EMD wurden von Prof. Bas van Steensel (Niederländisches Krebsinstitut (NKI)) gestiftet. DamID-seq wurde wie beschrieben durchgeführt,58 mit Modifikationen. Kurz gesagt, die aus HEK293T-Zellen erzeugten Dam- und Dam-EMD-Lentiviren wurden durch Ultrazentrifugation bei 19.400 × g für 2,5 h konzentriert. CLOCK +/+ und CLOCK-/- hMSCs wurden in Sechs-Well-Schalen mit 2 × 105 Zellen pro Well ausgesät. Jede Gruppe hatte drei biologische Replikate. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium durch 2 ml frisches Kulturmedium ersetzt, das entweder Dam oder Dam-EMD-Lentivirus enthielt. 72 h nach der Transduktion wurden Zellen geerntet und genomische DNA mit einem DNM Blood & Tissue Kit (69504, Qiagen) isoliert. DPNI (R0176S, New England Biolabs)-Digestion, Adapterligation, DpnII (R0543S, New England Biolabs)-Digestion, PCR-Amplifikation und Aufreinigung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.58 Zum Adaptertrimmen wurde die amplifizierte DNA beschallt und mit AlwI (R0513S, New England Biolabs) verdaut. Die DNA-Bibliothek wurde mit einem NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina (E7370S, New England Biolabs) erstellt. Die Bibliotheken wurden gepoolt und einer Paired-End-Sequenzierung mit 150-bp-Leselängen auf Illumina NovaSeq-Sequenzern unterzogen.

DamID-seq-Datenverarbeitung

Raw-Lesevorgänge von Dam- und Dam−EMD−Daten für CLOCK +/+- und CLOCK-/- hMSCs wurden in der Trim Galore-Software (Version 0.4.5) getrimmt (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Getrimmte Lesevorgänge wurden mit Bowtie 2 (Version 2.2.9) auf das humane hg19-Genom von UCSC abgebildet.96 PCR-Duplikate wurden mit den MarkDuplikaten entfernt.jar-Programm in Picard Tools. Anschließend wurden die Lesevorgänge mit SAMtools (Version 1.6) sortiert. Um den Effekt der Sequenzierungsverzerrung und -tiefe zu minimieren, wurden verarbeitete Lesevorgänge aus drei Replikaten für jede Probe zusammengeführt. Dann wurde die gleiche Anzahl (110 Millionen) hochwertiger Lesevorgänge für jeden Zelltyp zufällig für die Downstream-Analyse ausgewählt. Um die DamID-Signale zu visualisieren, berechneten wir das log2-Verhältnis der Lesevorgänge pro Kilobase pro Million zugeordneter Lesevorgänge (RPKM) der Dam-EMD− und Dam−Signale (log2 (Dam-EMD / Dam)) in CLOCK +/+ und CLOCK-/- hMSCs für jeden 10-bp-Bin mit dem bamCompare-Programm in deepTools (Version 2.5.4-2-5ee467f) Software.

Zur Identifizierung von LAD-Regionen in CLOCK +/+ und CLOCK−/− hMSCs berechneten wir zunächst die DamID-Signale (log2-Verhältnis der RPKM der Dam−EMD− und Dam-Signale (log2 (Dam-EMD / Dam)) in CLOCK+/+ und CLOCK-/- hMSCs für jeden 2-kb-Bin mit dem bamCompare-Programm in der deepTools-Software (Version 2.5.4-2-5ee467f). Dann haben wir das R-Paket für Hidden Markov-Modelle mit t-Emissionen (HMMt) (Version 0.1) implementiert, um LADs (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R) zu identifizieren.

Um die DamID−Signale in LAD−Regionen zwischen CLOCK+/+ und CLOCK−/− hMSCs zu vergleichen, haben wir LAD−Regionen, die in CLOCK+/+ und CLOCK−/- hMSCs identifiziert wurden, zu Union-Regionen zusammengeführt und das relative DamID-Signal (DamID-Signal in CLOCK-/- hMSCs minus DamID-Signal in CLOCK+/+ hMSCs) für jede Union-LAD-Region berechnet. Anschließend wurden die relativen DamID-Signale für LAD-Regionen mit dem R-Paket-Rideogramm (Version 0.2.2) aufgetragen, wie in der Zusatzinformation Fig. S4d.97

ChIP-qPCR und ChIP-seq

In Kürze wurden 1 × 106 CLOCK+/+ und CLOCK−/− hMSCs in 1% (vol/vol) Formaldehyd in PBS für 8 min bei Raumtemperatur vernetzt und die Reaktion durch Inkubation mit 125 mM Glycin für 5 min bei Raumtemperatur abgebrochen. Anschließend wurden die Proben für weitere 10 min auf Eis lysiert. Nach Beschallung im fokussierten Ultraschallgerät Covaris S220 (Covaris) und Zentrifugation für 10 min bei 12.000 ×g bei 4°C wurden Überstände über Nacht bei 4°C mit Protein A Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004D) konjugiert mit einem Anti-CLOCK-Antikörper, einem Anti-H3K9me3-Antikörper oder Kaninchen-IgG inkubiert. Anschließend wurden Elution und Rückvernetzung bei 68°C für 2 h in einem Thermomixer durchgeführt. Anschließend wurde DNA über Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion und Ethanolfällung isoliert. Die gereinigte DNA wurde einer qPCR zur Auswertung der UHR- oder H3K9me3-Besetzung bei repetitiven Sequenzen unterzogen. Die angereicherten Fragmente wurden in Bibliotheken ohne den Einbau von Spike-in-Kontrollen über KAPA Hyper Prep Kits mit PCR-Bibliothek Amplifikation / Illumina-Serie (KK8504, New England Biolabs) nach den Anweisungen des Herstellers konstruiert. Alle Experimente wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet.

ChIP-Seq-Datenverarbeitung

Für die Verarbeitung von H3K9me3-ChIP-Seq-Daten wurden rohe Lesevorgänge mit der Trim Galore-Software (Version 0.4.5) getrimmt (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Getrimmte Lesevorgänge wurden mit Bowtie 2 (Version 2.2.9) auf das humane hg19-Genom von UCSC abgebildet.96 Doppelte Lesevorgänge wurden mit MarkDuplicates entfernt.jar-Programm in Picard Tools. Anschließend wurden die Lesevorgänge mit SAMtools (Version 1.6) sortiert. Um den Effekt der Sequenzierungsverzerrung und -tiefe zu minimieren, wurden verarbeitete Lesevorgänge aus drei Replikaten für jede Probe zusammengeführt. Dann wurde die gleiche Anzahl (130 Millionen) hochwertiger Lesevorgänge für jeden Zelltyp zufällig für die Downstream-Analyse ausgewählt. Um die ChIP-seq-Signale zu visualisieren, berechneten wir die normalisierten Lesewerte, indem wir die RPKM-Werte für jeden 10-bp-Bin bestimmten. Für H3K9me3 Peak Calling wurde SICER (Version V1.1) mit dem Parameter “-w 200 -g 3” verwendet.98 Nur H3K9ME3-Peaks mit einem Cutoff-FDR von 1% oder höher wurden beibehalten.

Zur Identifizierung von “H3K9me3-Bergen” wurde das H3K9me3-Signal in Counts per Million (CPM) in jedem H3K9me3-Peak berechnet. Wir haben dann die H3K9me3-Peaks in der Reihenfolge des ansteigenden H3K9me3-Signals eingestuft und die H3K9me3-ChIP−Seq−Belegung in CLOCK +/+ und CLOCK-/- hMSCs aufgetragen, wie in Zusatzinformationen gezeigt, Abb. S4f. Diese Diagramme zeigten einen klaren Punkt, an dem das H3K9me3-Belegungssignal schnell zuzunehmen begann. Dann wurden die Wendepunkte dieser Kurven bestimmt. Wir definierten weiter H3K9me3-Gipfel oberhalb der Wendepunkte als “H3K9me3-Berge” und H3K9me3-Gipfel unterhalb dieser Punkte als typische H3K9me3-Gipfel.

ATAC-seq

ATAC-seq wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.99 In Kürze wurden insgesamt 50.000 Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in 50 µL Lysepuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0,1% (v/v) Nonidet P400) resuspendiert. Die Suspension der Kerne wurde dann bei 500 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, gefolgt von der Zugabe von 50 µL Transpositionsreaktionsmix (10 µL 5 × TTBL-Puffer, 4 µL TTE-Mix und 36 µL nukleasefreies H2O) aus einem TruePrep DNA Library Prep Kit V2 für Illumina (Vazyme Biotech). Anschließend wurden die Proben 30 min bei 37°C inkubiert. Die Bibliotheken wurden dann mit dem TruePrep DNA Library Prep Kit V2 für Illumina (Vazyme Biotech) amplifiziert und gereinigt. Die Bibliotheksqualität wurde mit einem Fragmentanalysator bewertet. Schließlich wurden Bibliotheken auf Illumina HiSeq X-Ten-Plattformen mit Paired-End-Sequenzierung mit 150-bp-Leselängen sequenziert.

ATAC-seq-Datenverarbeitung

Für die Verarbeitung von ATAC-seq-Daten wurden Raw-Reads mit der Trim Galore-Software (Version 0.4.5) getrimmt (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Getrimmte Lesevorgänge wurden mit Bowtie 2 (Version 2.2.9) mit dem Parameter “-X 2000 -N 1 -L 25 -no-mixed -no-discordant -t”.96 Doppelte Lesevorgänge wurden mit MarkDuplicates entfernt.jar-Programm in Picard Tools. Anschließend wurden die Lesevorgänge mit der Software SAMtools (Version 1.6) sortiert. Anschließend wurden verarbeitete Lesevorgänge aus drei Replikaten für jede Stichprobe zusammengeführt. Um die ATAC-Signale zu visualisieren, haben wir jeden Lesevorgang um 250 bp erweitert und die Lesevorgänge um den RPKM-Wert für jeden 10-bp-Bin normalisiert. Für ATAC Peak Calling wurde MACS2 (Version 2.1.1.20160309) mit dem Parameter “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits” verwendet.100 wurden nur ATAC-Peaks mit q-Werten < 0,01 beibehalten. ATAC-Peaks, die in CLOCK+/+, aber nicht in CLOCK−/− hMSCs identifiziert wurden, wurden als “Geschlossene” ATAC−Peaks definiert; ATAC−Peaks, die in CLOCK-/-, aber nicht in CLOCK+/+ hMSCs identifiziert wurden, wurden als “Geöffnete” ATAC-Peaks definiert. Abschätzung der genomischen Verteilung der verwendeten ATAC-Peaks annotatePeaks.pl programm in homer Software.101

Bewertung der Reproduzierbarkeit der Sequenzierungsdaten

Zur Bewertung der Reproduzierbarkeit der H3K9me3-ChIP-Seq- und ATAC-seq-Daten wurde der euklidische Abstand zwischen Replikaten wie folgt berechnet: die Lesevorgänge wurden vom RPKM bei einer Bin-Größe von 2 kb gezählt und normalisiert. Anschließend wurde der euklidische Abstand in R (Version 3.5.1) berechnet, um die Reproduzierbarkeit zu bewerten. Niedrigere euklidische Abstände bedeuten höhere Korrelationen. Um die Reproduzierbarkeit von DamID-seq-Daten zu bewerten, wurde die Hauptkomponentenanalyse (PCA) in R (Version 3.5.1) durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit von RNA-seq-Daten zu bewerten, wurden Streudiagramme basierend auf dem regularisierten Logarithmus (rlog) -normalisierten Lesezähler mit DESeq2 gezeichnet und der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen Replikaten berechnet.

Tierversuche

Zur Analyse der Teratombildung, NOD /SCID-Mäuse (6-8 Wochen alt, gekauft von Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) wurden 3×106 CLOCK+/+ oder CLOCK−/− hESCs in einer Matrigel:mTeSR (1:4) Lösung injiziert. Teratome wurden 8-12 Wochen nach der Injektion zur weiteren Analyse geerntet.

Für hMSC-Transplantationstests wurden 1 × 106 CLOCK +/+ oder CLOCK−/ − hMSCs, die mit Lentiviren, die Luc exprimieren, transduziert wurden, in den TA-Muskel von Nacktmäusen (6-8 Wochen alt) injiziert. Mäuse wurden dann mit D-Luciferin (LUCK-1G, GoldBio) behandelt und mit einem IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen, Inc, Waltham, MA, USA) abgebildet. Biolumineszenzbilder wurden im “Auto” -Modus aufgenommen. Jede Gruppe hatte sechs biologische Replikate. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet.

Für die alterungsassoziierte Clock-Level-Detektion wurden Mäuse unterschiedlichen Alters (jung, 1 Monat, n = 5 Mäuse; alt, 15 Monate, n = 10 Mäuse) eingeschläfert und die Gelenke für die RT-qPCR-Analyse gesammelt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet.

Um zu untersuchen, ob die lentivirale Verabreichung von CLOCK altersbedingte Syndrome lindern kann, wurden Lentiviren, die Luc (n = 14 Mäuse) oder CLOCK (n = 13 Mäuse) exprimieren, in die Gelenkhöhlen von 18 Monate alten Mäusen injiziert (gekauft von SPF (Beijing) Biotechnology) und nach 8 Wochen Injektion aufgefüllt. Das Laufbandexperiment wurde 15 Wochen nach der ersten Injektion von Lentiviren durchgeführt, die Luc oder CLOCK exprimieren. Im Detail wurden Mäuse auf einem Laufband (SA101, SANS) bei einer Neigung von 5 ° über 3 Tage für 20 min pro Tag trainiert, wobei die Geschwindigkeit von 0 auf 20 m / min beschleunigt wurde. Am Testtag liefen die Mäuse auf dem Laufband mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 0 m / min, und dann wurde die Geschwindigkeit um 2 m / min auf 20 m / min erhöht. Die gesamte Laufzeit wurde auf 20 min eingestellt. Die Häufigkeit des leichten Elektroschockreizes wurde aufgezeichnet und analysiert (Luc, n = 14 Mäuse; CLOCK, n = 13 Mäuse). Die Mikro-CT-Untersuchung wurde 16 Wochen nach der ersten Injektion durchgeführt (Luc, n = 14 Mäuse; CLOCK, n = 13 Mäuse). Mäuse wurden dann eingeschläfert, und die Gelenke wurden zur histologischen Beurteilung (Luc, n = 14 Mäuse; CLOCK, n = 13 Mäuse) und mRNA-Quantifizierung (Luc, n = 12 Mäuse; CLOCK, n = 12 Mäuse) gesammelt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen T-Test eines ungepaarten Studenten mit zwei Schwänzen bewertet.

Histologie und Immunhistochemie

Zur histologischen Analyse wurden geerntete Mausgelenke mit 4% PFA für 2 Tage fixiert und nach Entkalkung für 14-21 Tage in Paraffin eingebettet. Schnitte (5 µm) wurden mit fast green FCF (0,02%) und Safranin O (0.1%) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Die immunhistochemische Färbung wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen DAB-Färbemethode mit einigen Modifikationen durchgeführt.33,34,102 Zunächst wurden Objektträger entparaffiniert und mit Xylol und verschiedenen Alkoholkonzentrationen rehydriert. Die Antigen-Retrieval wurde unter Verwendung von Trypsin (ZLI-9010, ZSGB-BIO) Verdauung für 20 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Wasserstoffperoxid (3%) wurde verwendet, um die endogene Peroxidaseaktivität durch Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur zu blockieren. Die Objektträger wurden dann mit 10% Eselsserum für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und mit einem Anti-P16-Antikörper (Ab54210, Abcam, 1:200) bei 4°C über Nacht und mit einem Sekundärantikörper (PV-6002, ZSGB-BIO) für 1 h bei Raumtemperatur vor der DAB-Färbung (ZLI-9017, ZSGB-BIO) inkubiert.

Ethische Erklärungen

Die an dieser Studie beteiligten Experimente folgten den Grundsätzen für das Antragsformat für die ethische Genehmigung von Tierstudien und wurden im Voraus vom Institutional Animal Care and Use Committee des Instituts für Zoologie (Chinesische Akademie der Wissenschaften) genehmigt. Die Anästhesie der Mäuse erfolgte mit Isofluran und die Euthanisierung mit CO2, gefolgt von einer zervikalen Dislokation.

Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit der Graph-Pad Prism-Software durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM oder SD dargestellt. Vergleiche wurden mit dem T-Test eines zweischwänzigen ungepaarten Schülers durchgeführt. Der P-Wert (p) < 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert.