(A) den sexuella livscykeln för Chlamydomonas reinhardtii består… / Ladda Ner Vetenskapligt Diagram

… naturen hos de genetiska ämnena som trotsade Mendels lag. Omfattande studier under det senaste århundradet, med hjälp av många tekniker, inklusive elektronmikroskopi, genetik, molekylärbiologi och biokemi, har visat att de genetiska ämnena faktiskt är genom inom kloroplaster och mitokondrier (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Kloroplaster (CP) och mitokondrier (mt) tros ha uppstått från förfädernas endosymbiotiska förhållanden mellan kärnbildade celler och fritt levande bakterier-cyanobakterier respektive alfa – lila bakterier. De innehåller sina egna genom, som förmodligen är rester från deras förfäder (grå 1992). Idag vet vi att cp-och mt-gener överförs till avkomman enbart från moderföräldern i de olika tax av högre växter, ormbunkar, mossor, alger (Kuroiwa 1991), svampar (Mitchell och Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), och djur (Hutchison et al. 1974), inklusive människor. Det uniparentala arvet av cp / mt-genom ansågs länge vara ett passivt resultat baserat på det faktum att ägg innehåller flera antal organeller, medan manliga könsceller i bästa fall bara bidrar med några få (Gyllensten et al. 1991). Processen med uniparental arv är dock sannolikt mer dynamisk. Ett klassiskt och slående exempel skulle vara förekomsten av icke-Mendelian arv i de encelliga gröna algerna, Chlamydomonas reinhardtii , som producerar gameter av identiska storlekar (isogamous) (Sager 1954). Livscykeln för C.reinhardtii är utsökt enkelt. Det finns två parningstyper av C. reinhardtii, parningstyp plus (mt+) och parningstyp minus (mt), styrd av en enda komplex parningstyp loci på länkgrupp VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii genomgår en sexuell livscykel, som inkluderar definierade differentieringsstadier (Figur 1). Vegetativa celler differentierar sig till gameter under förhållanden med kvävehushållning och ljusbestrålning (Pan et al. 1996). Inom några minuter efter att ha blandats fäster gameter av motsatta parningstyper varandra genom deras flagella och smälter samman för att bilda zygoter. Efter en obligatorisk viloperiod genomgår zygoten meios och spiring för att producera fyra haploida avkommor. Mer än 90% av avkomman som bildas ärver kloroplast (cp) egenskaper, företrädesvis från mt + – föräldern, ett fenomen som först beskrivits för mer än 50 år sedan (Sager 1954). Sager beskrev arvsmönstren för två UV-inducerade mutationer, sr1 och sr2 . SR1-mutationen ger resistens mot låga nivåer av antibiotikumet streptomycin, och SR2-mutationen ger resistens mot höga nivåer av streptomycin. När sr1 korsades till en streptomycinkänslig stam, var låga nivåer av streptomycinresistens ärvt, efter Mendels lag. Däremot, när en mt+ – förälder som bär SR2-mutationen korsades till en känslig mt-förälder, var alla meiotiska avkommor resistenta mot höga nivåer av streptomycin. I det ömsesidiga korset var den meiotiska avkomman alla streptomycinkänsliga (Sager 1954). 1962 kom bevis för förekomsten av cpDNA från ljus-och elektronmikroskopiskt arbete av Ris och Plaut (Ris och Plaut 1962). Bara ett år senare beskrev Sager och Ishida isoleringen av cpDNA med cesiumklorid (CsCl) densitetsgradientcentrifugering (Sager och Ishida 1963). 1989 visade sig SR2-mutationen lokaliseras inom rps12-genen i cp-genomet (Liu et al. 1989). 1972 visade en biokemisk studie att mängden mt – cpDNA minskade i förhållande till mt + cpDNA, 6-24 h efter parning (Sager och Lane 1972). DNA från mt + och mt – gameter märktes med antingen 14 N – eller 15 NH4 Cl, och CSCL – densitetsgradientcentrifugering användes för att övervaka ödet för kärn-DNA och cpDNA i 6-och 24-h-zygoter. Sex timmar in i zygoteutveckling var signalen som representerar mt-cpDNA klart lägre än mt+ cpDNA, vilket indikerar en preferensminskning av mt – cpDNA relativt mt+ cpDNA. 1980 tillhandahölls de första molekylära bevisen för förmånsminskningen av mt – cpDNA av Grant et al. (Grant et al. 1980). Författarna övervakade beteendet hos mt + och mt – cpdna och utnyttjade restriktionsfragmentlängdspolymorfismer (RFLPs) i en C. reinhardtii mutantstam ac-u-g-23 som bär två små deletioner i sitt kloroplast-DNA. Författarna fann att både borttagningarna i cpDNA och den icke-fotosyntetiska fenotypen var uniparentalt ärvda. Kloroplastgenomet 203 kb av C. reinhardtii (Maul et al. 2002) är närvarande vid ~80-100 kopior per cell och är organiserad i 5-10 DNA–proteinkomplex, som kallas kloroplastnukleoider (Kuroiwa et al. 1981). 1982, Kuroiwa et al. fann att DAPI (dsDNA-specifikt fluorokrom, 4′,6-diamidino-2-fenylindol) – färgade mt-cp-nukleoider försvann företrädesvis i unga zygoter inom 50 min efter parning (Kuroiwa et al. 1982). 1999 observerades preferensförsvinnandet av mt – cp-nukleoider i en levande zygot med användning av SYBR Green i (dsDNA-specifikt fluorokrom som kan tränga in i levande celler) (Figur 1) (Nishimura et al. 1999). Tolkningen av detta dramatiska fenomen var emellertid kontroversiellt eftersom preferensförsvinnandet av fluorescerande mt – cp-nukleoider inträffade långt innan DNA-reduktion detekterades med biokemiska eller molekylärbiologiska metoder (6-24 h efter parning) (Sager och Lane 1972). Två primära möjligheter föreslogs för att förklara detta. En möjlighet var att sönderfallet av CP-nukleoider kan leda till dispersionen av cpDNA-molekyler, och den andra möjligheten var att den snabba matsmältningen av cpDNA-molekyler kan leda till att cpDNA-nukleoider försvinner. Ett problem med att ta itu med denna fråga är att parningsreaktionen utförs med miljontals mt+ och mt – gameter (Figur 2). Cellpopulationen är oundvikligen en heterogen blandning av celler, såsom omaterade mt+ och mt – gameter, zygoter med eller utan mt – cp-nukleoider och exceptionella meitotiska zygoter (1~5%) som inte bildar meitotiska zygoter (Ebersold 1967). I allmänhet kräver molekylära och biokemiska metoder stora mängder homogena prover för exakta analyser, och all heterogenitet i proverna skulle förvirra resultaten. Med andra ord skulle “personligheterna” hos enskilda celler eller organeller inom en befolkning spädas ut och troligen förloras i analysprocessen. Å andra sidan kan mikroskopi avslöja “personligheterna” på morfologisk nivå, men inte på molekylär nivå. För att studera tillståndet för cpdna-molekyler under försvinnandet av mt – cp – nukleoider var det nödvändigt att samla zygoter baserat på närvaron eller frånvaron av mt-cp-nukleoider och att analysera de enskilda zygoterna med hjälp av molekylärbiologiska tekniker. För att uppnå detta användes optiska pincett (Figur 3). Användningen av optisk pincett är en ny teknik för att manipulera levande celler eller organeller under direkt mikroskopisk observation (Ashkin et al. 1987). I denna studie samlades en enda zygot med eller utan cp – nukleoider med användning av optisk pincett, och närvaron eller frånvaron av mt-cpDNA-molekyler bestämdes genom kapslad PCR-analys. De enskilda öden för mt + och mt – zygotisk cpDNA följdes separat med användning av en kloroplasttransformant LO3c , som har bakteriegenen aadA (aminoglykosidadenyltransferas). De enskilda zygoterna som erhölls med de optiska pincettarna utsattes för mycket känslig kapslad PCR-analys för aadA (Figur 4)(Nishimura et al. 1999). När l03c mt+ gameter korsades med vildtyp mt-gameter, Aada-gensekvenser detekterades i alla zygoter som undersöktes. Tvärtom, när l03c mt – gameter korsades med gameter av vildtyp, förstärktes aadA-sekvenserna endast i yngre zygoter (10 och 30 min efter zygotbildning). Efter att de fluorescerande mt-cp-nukleoiderna försvann detekterades inte aadA-sekvenserna längre i zygoterna (90 och 120 min efter zygotbildning). Dessa resultat indikerar att mt-cpDNA-molekylerna fullständigt smälts på 10 minuter, under vilka mt – cp – nukleoiderna försvinner, och också att minst ett mycket effektivt nukleas aktiveras i mt-kloroplasten strax efter zygotbildning. Denna aktiva matsmältning av mt-cpDNA är förmodligen grunden för moderns arv av cpDNA. Den enklaste modellen för uniparental arv av cpDNA är att processen består av två distinkta händelser som sannolikt kommer att inträffa i olika stadier av livscykeln: ett “skydd” av mt+ cpDNA, kanske under gametogenes, och en “förstörare” av oskyddad mt – cpDNA under tidig zygoteutveckling. A) restriktion –Metyleringshypotes 1972 föreslog Sager och kollegor att mt – cpDNA smältes genom verkan av restriktionsenzymer, medan mt+ cpDNA skyddades genom metylering – en modell som är analog med det bakteriella restriktionsmetyleringssystemet (Sager och Lane 1972). Sager och kollegor ackumulerade snabbt övertygande bevis som visar en ökning av metyleringsnivån för mt+ cpDNA, som detekterades 7 h efter parning (Burton et al. 1979; Royer och Sager 1979; Sano et al. 1980). Vidare har reningen av mt + gamete-specifika DNA-metyltransferaser, med molekylvikter på 60 kDa och 20 kDa, rapporterats (Sano et al. 1981). Denna mt + gamete-specifika metyleringshändelse var uppenbarligen reversibel, vilket skulle förväntas för skydd (Sano et al. 1984). Genen för kloroplastboende DNA-metyltransferas identifierades slutligen 2002 och dess mt+ gamete-specifika uttryck och kloroplastlokalisering bekräftades (Nishiyama et al. 2002). Å andra sidan har en serie papper från oberoende grupper senare hävdat att metylering av mt+ cpDNA inte kunde förklara skyddet tillräckligt. Bolen et al. isolerade en nukleär mutant me1 som konstitutivt metylaterar cpDNA på en högre nivå i både mt+ och mt – celler (Bolen et al. 1982). När ME1-gameter användes för kors, normala uniparentala arvsmönster observerades, inkonsekvent med …