Alpha Cetsa Knowledgebase

• cetsa-analys
• Target / Provtyper
• cetsa-analys villkor
• Alfa-cetsa-immunanalyser
• cetsa-analys och tolkning av data

Varning: Endast för forskningsanvändning. Cetsa är ett registrerat varumärke som tillhör Pelago Bioscience AB. Observera att ett giltigt cetsa-abonnemang krävs för användning av kit.

cetsa-metoden i sig

F : Vad är cetsa-exporten?

A : Den cellulära termiska Skiftanalysen är en metod som tillåter kvantifiering av en förenings Målförlovning (TE) i levande celler eller i störda celler. Cetsa-analysprincipen är baserad på förändringen i termisk denatureringsprofil för målproteinet som uppstår efter bindningen av en förening. Cetsa-analysen utförs genom att inkubera cellerna med testföreningen, följt av uppvärmning av de sammansatta behandlade cellerna och sedan genom mätning av det återstående lösliga målproteinet.

F: Vad är termisk förskjutning

A: Vid uppvärmning kommer ett protein att stöta på en temperatur vid vilken denaturerar (ibland kallad smältpunkten). Denna smälttemperatur är en fysisk egenskap och en konstant för varje given uppsättning förhållanden (pH, tryck, salter). Föreningar som interagerar med ett protein kommer att ändra smälttemperaturen (termisk Skift). För ett givet bindningsställe inom ett protein kan storleken på det termiska skiftet mätas vid olika föreningskoncentrationer (dosrespons) och EC50-värdena härledda från sådana kurvor kan användas för att fastställa en rangordning av styrkan hos en serie föreningar, som direkt korrelerar med rangordningen för föreningarnas affinitet . Det finns flera variationer på in vitro termisk Skiftanalys, men nyckeltekniken beskrevs först av Semisotnov et al. (1991). I denna metod exponerar det smältande och utfällande proteinet hydrofoba ytor som gör det möjligt för SYPRO orange att binda. Detta färgämnen fluorescens släckes i vatten, så bindningen till dessa hydrofoba ytor vänder detta och orsakar fluorescens till topp när proteinet är helt ovikta. Denna typ av termisk Skiftanalys kan endast appliceras på högrenade proteiner och för arter med låg överflöd kan detta innebära att ett överuttryckssystem krävs för att generera tillräckliga mängder.

Termofluor – temperaturkänsligt färgämnessystem (med Sypro Orange)

differentiell skanningsfluorimetri – DSF) – alternativa färgbaserade metoder

Kvantitiva PCR-system (t. ex. Roche Light cycler) : dessa används för att leverera uppvärmningshändelsen och kan mäta fluorescensförändringar

Nanotemper – är ett företag som tillverkar dedikerat instrument som värmer provet och mäter fluorescensen. Det ger bättre prestanda än de anpassade PCR-systemen.

f: Varför är det viktigt att mäta Målengagemang?

A: i avsaknad av bekräftelse på att en förening verkligen interagerar med det önskade målet kan läkemedelsutvecklare förlora dyrbar tid och resurser som rör sig i fel riktning. Av den anledningen har bekräftelse av en förenings Målinvolvering länge betraktats som väsentlig vid läkemedelsupptäckt. Sådana analyser möjliggör direkta jämförelser av en förenings affinitet för dess mål som ska göras, som sådan är det en viktig åtgärd för att välja vilka föreningar att avancera i alla stadier av blygenerering och optimering. Eftersom mål engagemang kan korreleras till affinitet det gör det möjligt för forskare att välja föreningar som har de högsta affinitetsvärdena. Som sådan är det en extremt användbar åtgärd för att säkerställa korrekt föreningsprioritering vid varje steg i läkemedelsupptäcktsprocessen.

F: Hur skiljer sig cetsa VIII från andra termiska Skiftanalysteknologier?

A: förutom cetsa, finns det många metoder för att bedöma Målinvolvering (t.ex. Ytplasmonresonans, Fluorescenspolarisering och termisk förskjutning). Alla dessa metoder är dock beroende av att renat protein är tillgängligt och kan endast tillämpas in vitro, vilket innebär att de härledda affinitetsvärdena kanske inte är prediktiva för faktisk affinitet eller bindningspotential i levande celler. Att kunna köra termiska Skiftanalyser i ett relevant cellulärt sammanhang, där proteinet är i sin naturliga miljö, i närvaro av dess naturliga partnerproteiner, med fysiologiska koncentrationer av dess kofaktorer och substrat, ger mycket mer relevanta data, som bättre kommer att översättas till djurmodeller och kliniska prövningar.

medan den cellulära termiska Skiftanalysen är en metod baserad på samma biofysiska princip som standard termiska skiftanalyser (dvs. att specifika proteiner kommer att denaturera vid en inställd temperatur) mäter den inte direkt den specifika temperaturen för utfällning, utan förlitar sig istället på det faktum att närvaron av en förening på proteinet kommer att påverka mängden lösligt protein som finns efter uppvärmning till en inställd temperatur. Som sådan är cetsa bisexuell i huvudsak en total proteinanalys som utförs efter en specifik uppvärmningshändelse. Föreningar med olika målförlovningsförmåga kommer att förändra de relativa mängderna protein som överlever uppvärmningshändelsen. Eftersom analysen mäter detta kvarvarande protein, snarare än den faktiska smälthändelsen, kan den appliceras på mer komplexa in vivo-system såsom celler och lysater (och i vissa cetsa-format även fast vävnad). Dessutom kan cetsa VIII identifiera föreningar som destabiliserar ett protein (dvs. minska dess smälttemperatur), detta är mindre rakt fram med de andra termiska skiftmetoderna.

Q: Hur skiljer sig Alpha CETSA från andra cellulära termiska Skiftanalysteknologier eller andra cellulära Målanalyser?

A: som nämnts ovan är CETSA bisexuell i grunden en total proteinanalys utförd efter värmechock. Alpha cetsa använder en dubbel antikropp närhet baserat detekteringssystem. Andra metoder undviker användningen av ett antikroppsbaserat system genom att modifiera målproteinet:

• Promega nanoluciferas thermal shift assay (NaLTSA): Nanoluc luciferas smält till målproteinet (rekombinant uttryckt protein); När proteinmålet med Nanoluc-enzymet taggaggregat kommer luciferassignalen att minska.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay: luciferas Fusion Tag kombinerat med märkta spårföreningar som, när de är i närheten av luciferas, kommer att leda till bioluminescens Resonansenergiöverföring (BRET). Förening bindning i samma ficka kommer att förskjuta spåraren och BRET signalen kommer att minska. Detta är inte en värmechockmetod.
• DiscoverX InCELL puls: baserat på Enzymfragmentkomplementation (EFC) – teknik : målproteinet smälts samman med ett litet enzymdonatorfragment av sackarios-galaktosidas (sackarios-gal). Ett tillsatt reporter-protein kommer att binda till detta fragment för att rekonstituera ett aktivt enzym, vilket kommer att hydrolysera ett substrat och generera en kemiluminescerande signal som möjliggör kvantifiering av proteinöverflöd. Efter värmedenaturering kommer proteinet att aggregera och begränsa åtkomsten av den större luciferas-komponenten till sin partner på proteinmålet.

huvudskillnaden mellan dessa ” rekombinanta cetsa-eller “rekombinanta målengagemang” – system och Alfa cetsa-bukspottkörtel, är att de inte kan appliceras på inhemska och omodifierade celler. Detta har ett antal negativa konsekvenser:

1. medan kostnaden för att utveckla ett nytt antikroppspar och de efterföljande kostnaderna per brunn kan vara högre än att bara transfektera en enda cellinje, är det troligt att något upptäcktsprogram kommer att vilja testas med en mängd olika modellcellinjer, varje transfektion kommer med sina egna kostnader och kloning ut de efterföljande cellinjerna kommer att ta ytterligare veckor.
2. att generera ett taggat protein kommer alltid att ha fysiologiska konsekvenser på cellen och det taggade proteinet kan vara (i) överuttryckt (fel stökiometri vs. partner), (ii) inte befinner sig i det korrekta cellulära facket eller (iii) inte associerat med nyckelpartnerproteiner och (iv) kan ha ett annat smältbeteende än det ursprungliga proteinet. Det betyder att den uppenbara effekten av en förening kanske inte återspeglar dess verkliga beteende i patientens vävnad. Dessa problem kan förstoras i alla tillfälliga transfektionssystem.
3. Luciferashämmare kan resultera i falska positiva träffar.
4. i senare skeden av blyoptimering när mer komplexa och fysiologiskt mer relevanta cellulära modeller (primära, nativa cellinjer och vävnad) krävs, är märkta proteinmetoder helt enkelt inte tillämpliga.

f: vilken information levererar en cetsa-analys?

A: cetsa Securities ger ett unikt mått på A-föreningar ‘på målnärvaro’ och kan betraktas som målbeläggning. Denna beläggning kommer att påverkas av både föreningarnas förmåga att engagera målet och föreningens förmåga att vara närvarande på rätt plats (dvs. har den rätt löslighet, permeabilitet, metabolisk stabilitet och tillgänglighet i rätt cellutrymme). Icke-cellulära mål Engagemangsanalyser erbjuder mått på affinitet som endast korrelerar med proteinets beteende i mycket artificiella miljöer som ofta använder renade rekombinant uttryckta målproteiner.

F: kan cetsa Macau användas för SAR-analysstudier?

A: Det finns inga publicerade exempel ännu där CETSA Macau har använts för sammansatt optimering. I alla fall, potentialen och tillämpligheten av CETSA brasilian som ska användas för SAR-analys och hitbekräftelse demonstrerades tydligt av Shaw et al. genom jämförelse av data från cetsa-analysen med vanliga biokemiska och cellbaserade analysdata (Shaw et al. 2018 SLA upptäckt 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). Publikationen demonstrerar mervärdet av CETSA VIII för screening, träffbekräftelse och SAR-generation för två proteinmål: B-Raf och PARP1.

mål – / Provtyper

F: Hur många mål har validerats i cetsa-tabellen hittills?

A: I CETSA Securities HT (de flesta är Alfa cetsa Securities, vissa använder HTRF) har mer än 30 mål validerats framgångsrikt, inklusive mål med kärn -, mitokondriell -, cytoplasmatisk och plasmamembranlokalisering.

mer än 100-mål har hittills validerats i Cetsa bisexual Classic (Western Blot based detection).

CETSA Securities m/S genererar information för 6000 till 7000 mål på en gång.

F: kan alla målproteiner testas i cetsa-bronkier?

R: vissa mål är “blinda” i cetsa, dvs. förening bindning kommer inte att förändra deras termiska stabilitet. Detta kan hända när proteinet har flera domäner, och föreningen är bindande till en enda domän, och om stabilisering av denna enda domän inte globalt påverkar den termiska stabiliteten hos hela proteinet. Det finns några proteiner som inte smälter i typiskt temperaturområde som används i cetsa-experiment.

Pelago har tillgång till en stor databas med värmestabilitetsdata från projekt med masspektrometrisk avläsning (CETSA Baccarat MS), och denna information beaktas när Pelago bedömer “cetsa Baccarat bility” för ett proteinmål innan man utvecklar en alfa CETSA Baccarat-analys. Kontakta Pelago för att begära sådan information.

F: är GPCR: er mottagliga för cetsa Macau ?

A: några exempel på GPCR: er har testats i CETSA GHz . I en nyligen publicerad publikation från Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019) fastställdes cetsa-klassikeranalyser för en uppsättning membranbundna proteiner inklusive ett GPCR-proteinmål. En potentiell utmaning med cetsa på GPCR kan vara begränsad tillgänglighet av antikroppar för detektion. Dessutom kan den integrerade membranlokaliseringen av GPRCs leda till oförutsägbart smältbeteende.

F:Vilken typ av prover kan testas i cetsa-bronkier?

A : Det finns exempel på cetsa-analyser med användning av många olika typer av matriser, inklusive odödliga cellinjer, primära celler, iPS-celler, patient-härledda Pbmc, sfäroider, kärnfraktioner från odlade celler, ex-vivo-behandlad vävnad, vävnader från in vivo djurstudier, bakterier, jäst, zebrafisk och insekter.

F: kan proverna frysas efter uppvärmningssteget?

A : Detta är möjligt, men detta kräver en validering från fall till fall eftersom frysprocessen kan denaturera vissa proteiner.

f: mina celler behöver odlingsplattbeläggning med vissa proteiner (t. ex. kollagen eller Matrigel); behövs särskild vård för att undvika provberedning?

A: Vi har inte stött på några problem med celler odlade på belagda plattor.

cetsa Securities Analysvillkor

f: vilka är de typiska Alpha CETSA Securities analysoptimeringspunkterna?

A: om du börjar från början måste immunanalysen utvecklas och optimeras först. Det är viktigt och värt att investera i att utveckla en mycket känslig Alfaanalys, eftersom det kommer att göra det möjligt att minska cellantalet per brunn som behövs i cetsa-analysen. Eftersom cetsa-analysen förstör en del av proteinet som behöver detekteras, behövs vanligtvis fler celler/brunnar i en cetsa-analys jämfört med andra cellbaserade analyser. Se PerkinElmer-guiderna för alfaanalysutveckling för hur du ska gå vidare och för användbara tips, och till cetsa-verktygslådans manualer om du använder toolbox (anti mouse Ig X anti rabbit ig beads) – metoden.

sedan inkluderar cetsa-analysoptimeringspunkterna:

• titrering av celldensitet
• val av celllysbuffert
• inkubationstid för celler med testföreningen
• temperatur för inkubation av celler med testföreningen
• fastställande av smält-och skiftkurvor
• val av temperatur för isotermiska dos-responsexperiment
• arbetsflödes-och automatiseringsinställningar

f: varför tillhandahålls olika cetsa-celllysbuffertar och vad är effekten av att använda olika celllysbuffertar?

A: Lysbufferten är viktig när det gäller flera aspekter av analysen. Dess roll är multipel: lysera cellerna och potentiellt frigöra målproteinet från partnerproteiner som kan störa antikroppsigenkänning, för att göra målet tillgängligt för detektion av antikropparna; stabilisera målproteinet för att göra analysen stabil; undvika eller minimera potentiell epiturbanseffekt; att tillhandahålla rätt fysikalisk-kemiska förhållanden (pH, jonstyrka och natur av salter, tvättmedelstyp och koncentration, … ) för immunanalysen, … eftersom olika immunanalyser kan ha olika optimala förhållanden, och som olika proteinmål och olika celltyper kan ha olika krav på optimal analysprestanda, gör vi 5 olika celllysbuffertar tillgängliga. Dessa ger en mängd olika celllysbetingelser. Detta innebär emellertid inte att ytterligare komponenter kan tillsättas i specifika fall, som ytterligare tvättmedelstyper, för att förbättra ytterligare analysprestanda.

f: finns det proteashämmare i cetsa-celllysbuffertarna?

A: cetsa-celllysbuffertar 1, 4 och 5 innehåller några tvåvärda katjonkelatorer, som förväntas hämma proteaser som kräver sådana tvåvärda katjoner för deras aktivitet (Matrismetalloproteinaser till exempel). Förutom detta ingår inga andra proteashämmare i cetsa-celllysbuffertarna för cetsa-celler, eftersom dessa i allmänhet inte behövs för att utföra alfa-cetsa-analyser. Men för specifika celltyper eller vävnadsprover kanske du vill lägga till typiska proteinashämmare, såsom leupeptin.

f: vilka är de typiska smälttemperaturerna?

A: smälttemperaturen (Tm) definieras som den temperatur vid vilken hälften av målproteinpopulationen har denaturerats (dvs. i alfa-cetsa-sackaros, vid vilken hälften av Alfaksignalen har förlorats). Beroende på målet är smälttemperaturen oftast mellan 40 C och 60 C, med en genomsnittlig smälttemperatur på 52 C. vissa proteiner, som membranassocierade proteiner, är vanligtvis mer stabila och kan ha en högre smälttemperatur. Cetsa-analysdata för proteiner med en smälttemperatur över 65 C kan påverkas av det faktum att membranpermeabiliteten och cellintegriteten störs när cellerna upphettas, vilket påverkar analysens fysiologiska betydelse.

enligt vår erfarenhet är smälttemperaturen målspecifik och beror på analysmatrisen och av den använda lysbufferten.

f: förväntas Tm vara detsamma när man arbetar med intakta celler och störda celler?

A: inte nödvändigtvis, som vid störning av celler, kan protein-proteininteraktioner som stabiliserar proteiner gå förlorade, vilket kan leda till en förändrad smälttemperatur jämfört med intakta celler. För ett exempel, se Alpha CETSA Portugals mek1-analysdata.

F: Vilken uppvärmningstemperatur ska jag välja för sammansatt testning?

A: För stabiliserande föreningar rekommenderas att välja den lägsta temperaturen med det största analysfönstret, eftersom det förväntas ge den mest känsliga analysen (lägre EC50-värden). För destabiliserande föreningar rekommenderas att välja den högsta temperaturen med det största analysfönstret. Temperaturer över 65 c c kan påverka cellpermeabiliteten och minska betydelsen av data.

F: ska jag förvänta mig samma smälttemperatur i CETSA Ukrainian classic (Western Blot) och Alpha cetsa Ukrainian?

A: inte nödvändigtvis: den uppenbara smälttemperaturen kan variera mellan båda metoderna, eftersom detekteringsmetoderna är olika.

F: är det viktigt att ha en strikt kontroll av provuppvärmningstider?

A: ja det här är oerhört viktigt att kontrollera eftersom längre uppvärmningstider kan leda till en rätt förskjutning av dos-responskurvan (se nedan kommentarerna om uppehållstid). Standard uppvärmningstid är 3 minuter.

föreningar med kort uppehållstid (dvs. hög dissociationshastighet konstant koff; uppehållstid T är lika med 1 / koff) kommer att dissociera snabbare från målet när det upphettas, jämfört med föreningar som har en lång uppehållstid. Av den anledningen förväntas EC50-eller ITDRF50-värdet öka med ökande uppvärmningstider. För mer förklaringar om cetsa-teorin se Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundb Jacobck T. (2018) kvantitativ tolkning av intracellulär Läkemedelsbindning och kinetik med hjälp av den cellulära termiska Skiftanalysen. Biokemi 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. I teorin, detektering av olika föreningar uppehållstider vid målet, genom varierande uppvärmningstid kan vara möjligt men det finns inga publicerade rapporter ännu tillgängliga om detta har gjorts.

Q: manualen instruerar att antingen svalna på is, eller för 3 min vid 25 kcal C efter värmechocken. Är detta kylsteg viktigt och är det viktigt att ha en strikt kontroll över kyltiden?

A: kylning av provet säkerställer snabbt att värmechockfasen är väl kontrollerad. Att helt enkelt låta temperaturerna svalna utan hjälp skulle säkert ge olika kylhastigheter i olika brunnar och påverka mängden värmechock som levereras till systemet. Kylfasen är inte lika kritisk som uppvärmningsfasen men bör genomföras snabbt och konsekvent.

F: Kan jag använda PerkinElmer “Biomarker” och “SureFire” (icke-cetsa-kakor ) för att utföra en cetsa-kakor?

A: i teorin kan alla totala proteinanalyser vara lämpliga för användning i ett cetsa-protokoll, även om varje system måste optimeras och valideras. Cetsa-metoden är dock patenterad och tillstånd kommer att behövas från Pelago Bioscience. Dessutom stöds endast användningen av de utsedda målsatserna av PerkinElmer. Användningen av verktygslådan stöds av Pelago Bioscience och är endast tillgänglig för licensinnehavare.

F: är det möjligt att läsa Alfa-signalen direkt från PCR-plattan som används för att värma proverna?

R: Detta skulle ge fördelar när det gäller antalet pipetteringssteg, provförbrukning och enkel automatisering, men möjligheten att använda PCR – plattor för hela processen – från provbehandling till detektion-visas ännu inte. PCR-plattor är ofta mycket flexibla, vilket leder till ojämn signal över plattan, eller har inte rätt dimensioner för att de ska kunna hanteras av plattläsare. Well-to-well cross-talk kan också vara ett problem i sådana PCR-plattor.

F: kan kemisk denaturering (t. ex. användning av urea eller guanidin) användas istället för värme?

A: Fördelen med att använda temperaturen för att leverera värmechocken är att den görs på ett mycket kontrollerat sätt som sannolikt kommer att vara konstant mellan proverna och begränsad över en välkontrollerad tidsram. En kemisk denatureringsprocess kan fungera i ett renat proteinextrakt; men i den komplexa cellulära miljön kommer variation i cellvolym, buffertförmåga, lipidinnehåll etc sannolikt att innebära att olika celllinjer visar olika denatureringsegenskaper för ett givet protein.

eftersom denaturering (uppvärmningstid) är kritisk kan det vara ganska svårt att kontrollera om man använder kemisk denaturering. Dessutom kan värme appliceras utan att störa celler, vilket gör det möjligt att testa i verkligt cellulärt sammanhang. Detta skulle inte vara fallet med kemisk denaturering, eftersom celler skulle behöva störas för att tillåta målattgång till denatureringsmedlet och därför förlora intracellulära koncentrationer, proteinföreningar etc.. Därför rekommenderar vi inte att värmechocken ersätts med kemisk denaturering.

Alfa-cetsa-immunoassay för bukspottkörtel

Q: Behöver jag monoklonala antikroppar när jag utvecklar en cetsa-analys eller kan polyklonala antikroppar också användas?

A: både monoklonala eller polyklonala antikroppar kan användas, beroende på antikropparnas kvalitet. Monoklonala antikroppar uppvisar en fördel när det gäller stabil reagensförsörjning, som för alla andra detekteringsmetoder med användning av antikroppar.

F: När du använder polyklonala antikroppar, kommer nästa parti att fungera på samma sätt i en cetsa-askorbinanalys?

A: Enligt vår erfarenhet stod vi aldrig inför en situation där nästa parti av en polyklonal antikropp uppförde sig annorlunda i cetsa Kazaki-analysen jämfört med tidigare partier. Cetsa-analysen måste dock valideras på nytt med nästa parti av den polyklonala antikroppen.

f: finns det andra rekommendationer för antikroppsval?

A: om tillgängligt bör antikroppar väljas så att de täcker olika epitoper av målproteinet, för att maximera chanserna att hitta ett lämpligt antikroppspar som kommer att fungera i Alfa-cetsa-analysen.

Antikroppspar som ger brantare kurvor (högre sluttning) och mindre bakgrund föredras eftersom de vanligtvis ger en mer specifik signal. Låg sluttning kan vara tecknet på förmågan hos ett antikroppspar att känna igen det omvikta proteinet.

F: Är Alfa CETSA-antikropparna endast mot det endogena målproteinet eller det endogena målproteinet Plus bunden liten molekyl?

A: baserat på de satser som hittills utvecklats är antikropparna endast mot proteinmålet.

Q: Kan jag förvänta mig att detekteringsantikroppsaffiniteter skiljer sig mellan bunden och obunden liten molekyl för att rikta protein?

A: små molekyler som påverkar proteinvikning vid epitopställen riskerar verkligen att förändra antikroppsbindning. Detta fenomen kallas” epiturbance ” och kan vara en begränsning av antikroppsbaserad-CETSA VIII . Epiturbance observeras i allmänhet inte i CETSA-Classic-analysformatet (Western Blotting), eftersom proteinet i detta fall är fullständigt denaturerat före antikroppsdetekteringssteget.

F: kan endast IgG användas med cetsa Portugals verktygslåda?

A: Antikropparna på anti-kanin och anti-muspärlor är faktiskt specifika för IgG och skulle inte känna igen andra antikroppsklasser (dvs IgA, IgM, etc bör inte väljas).

f: finns det en fördel med att använda Alpha cetsa 2BX jämfört med Cetsa 6bxx Classic (Western Blotting)?

A: förutom större känslighet för Alfa CETSA-analysen och genomströmningen och automatiseringsöverväganden, på grund av den möjliga svårigheten att analysera membranproteiner i Cetsa-klassiska metoden, kan Alpha CETSA-metoden fungera bättre för sådana mål, eftersom det inte behöver något separationssteg.

cetsa Portugals dataanalys och tolkning

f: vilka falska positiva träffar kan erhållas i cetsa Portugals?

A: den termiska stabiliteten hos vissa proteiner kan påverkas efter föreningsbehandling, även om de inte är direkt bundna av testföreningen. Dessa indirekta effekter kan vara resultatet av till exempel proteinfosforylering, proteinrekrytering av ett partnerprotein eller från allmän förändring av cellens Redoxtillstånd. Att köra cetsa-analysen parallellt på intakta celler och på störda celler kan skilja mellan direkta och indirekta effekter, eftersom sådana indirekta effekter inte förväntas när cellerna störs och de metaboliska processerna stoppas.

Föreningsanalys intereferens kan påträffas i Alfa CETSA Kazaki eftersom föreningarna är närvarande i detektionssteget vid en relativt hög koncentration. Detta kan ge vilseledande resultat och det är viktigt att utföra en motskärm för att identifiera dessa föreningar.

F: Hur kan måldestabilisering tolkas?

A: Destabilisering kan bero på störningen genom föreningsbindningen av ett proteinkomplex som stabiliserade målproteinet. Enligt vår erfarenhet har membranproteiner vanligtvis en högre smälttemperatur och är ganska destabiliserade än stabiliserade genom föreningsbindning. För kinaser kan det också bero på förskjutningen av ATP. I ett sådant fall kan Jämförelse av resultatet av cetsa-analyser när de utförs på intakta celler (fysiologiska ATP-koncentrationer) och störda celler (förlust av ATP) vara användbar. För vissa mål (se ErbB2 Alpha CETSA Securities kit manual) har vi observerat att irreversibla hämmare destabiliserade målet medan en reversibel hämmare stabiliserade målet.

f: finns det ett sätt att undvika epiturbanseffekt?

A: lägga till en liten mängd tvättmedel, som 0,01% SDS, kan förhindra epiturbansfenomenet. En förklaring kan vara att SDS ger tillgång till antikroppen även i närvaro av föreningen. En del av cetsa-celllysbufferten innehåller en liten mängd SDS och kan därför undvika epiturbance över andra lysbuffertar. Vi kan inte utesluta att fler SD kan behöva läggas till i vissa fall.

det bör noteras att en sådan epiturbanceffekt inte är begränsad till cetsa-analyser utan kan också påträffas vid vilken immunanalys som helst.

Q: Counter-screen / Hur kontrollerar jag om min cetsa-träff är en falsk positiv?

A: i cetsa finns det en enkel metod som gör det möjligt att bestämma om föreningen verkar på målproteinets (de) stabilisering i sig eller stör detektionsmetoden: en jämförelse kan göras mellan (1) tillsats av föreningarna till cellerna, sedan inkubera och göra värmebehandlingen och (2) uppvärmning av cellerna först och tillsats av föreningen först efter. Om föreningsaktiviteten endast finns i test 1, är den verkligen aktiv vid målet. Om sammansatt aktivitet finns i 1 och 2, visar det sig att det på något sätt stör detektionstekniken (se PerkinElmer Protein-Protein interaction guide för en lista över potentiella alfainterferenser).

f: vilka falska negativa träffar kan erhållas i cetsa bisexual?

A: Om en förening inte når målet i ett cellulärt sammanhang kan det framstå som positivt i biokemiska analyser och fortfarande vara negativt i cetsa-bronkier . Detta är inte en falsk negativ, men återspeglar bara det faktum att föreningen inte kan komma åt målet under verkliga cellulära förhållanden, vilket är en del av metodens kraft.

F: Hur jämför cetsa-värden med funktionella analyser / finns det en betydelse för termoshiftamplituden?

A: Vid analys av cetsa-data måste man komma ihåg att analysprincipen är helt annorlunda än typiska funktionella analyser, såsom att titta på proteinfosforylering, jonkoncentrationer, cAMP och andra signaltransduktionsmarkörer eller fenotypisk analys vid screening med högt innehåll, och därför måste data tolkas i enlighet därmed.

amplituden för termoshift är inte ett mått på föreningsaffinitet.

EC50-eller ITDRF50-värdena är specifika för vissa analysförhållanden (temperatur, uppvärmningstid,…). Detta skiljer sig inte från funktionella analyser, där EC50-värden till exempel är specifika för stimuleringstider.

F: är det möjligt att diskriminera antagonister mot agonister i cetsa-analyser?

a: normalt är detta inte en information som utvinns från cetsa bisexuell analyser, men publikationen från Shaw et al. (2018) vetenskapliga rapporter | (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. rapporter om att endast agonister kunde stabilisera androgenreceptorn i cetsa-analysen utvecklades, medan antagonisten inte hade någon direkt effekt i cetsa-analysen, men kunde detekteras som konkurrenter av effekten av agonister i cetsa-analysen. I detta speciella fall kunde cetsa-analysen skilja mellan androgenreceptoragonister och antagonister. Detta innebär inte att detta är möjligt för något mål, eftersom det finns många exempel där cetsa-analysen direkt detekterar både agonister och antagonister.

Q: Kan cetsa bisexuell användas för att detektera toxicitet hos en förening?

A: föreningar som utövar någon toxisk effekt på en cell förväntas leda till förändringar i nivån av vissa proteiner (via nedbrytning och/eller transkriptionseffekter) och till förändringar i termostabilitet hos vissa proteiner (via post-translationella modifieringar eller allmän förändring av cellernas Redoxtillstånd). Pelago undersöker möjligheten att generera “cetsa-fingeravtryck” som kan kopplas till olika typer av toxicitet, från CETSA-MS-data. Detta kan också generera kunskap om mål som läkemedel inte bör träffa för att undvika sådan toxicitet. Om ett specifikt mål verkar vara kopplat till toxicitet, kan användning av Alfa CETSA kan bli en metod för val för läkemedelsindustrin.

F: kan ett hushållsprotein användas för normalisering av cetsa-analyser?

A: normalisering behövs vanligtvis inte i cetsa-analyser, eftersom den viktiga utsignalen från analysen är EC50-värdet. Men i vissa fall, till exempel när man arbetar med vävnadsprover, kan mängden material som används per datapunkt variera ganska signifikant och normalisering kan då vara önskvärd. I CETSA bisexuell Classic (Western blotting), SOD1 används ofta som dess smältpunkt 80 C gör det till en bra oföränderlig referens för alla mål, och eftersom dess molekylvikt på 18 kDa gör det lätt att upptäcka på Western blots. GAPDH skulle inte rekommenderas på grund av dess lägre smälttemperatur (55 kcal C), vilket gör det inte möjligt att kontrollera mål med högre smälttemperatur.

om du vill normalisera Alpha CETSA-analysen kan cofilin prövas (det finns ett AlphaLISA SureFire ultra-kit för total cofilin, med preliminära cetsa-data men inget fullständigt validerat kit ännu)