Antikroppsinriktning av claudin-1 som en potentiell kolorektal cancerterapi

CRC-prover

för profilering av genuttryck valde vi 143 tumörprover från 143 patienter som ingår i tre kohorter: den prospektiva singelcenterstudien REGP (19 patienter) (GSE62322), den retrospektiva multicenterstudien REGP (19 patienter) (GSE62322), den retrospektiva multicenterstudien studie cosival (68 patienter) och den prospektiva multicenterstudien biocolon (56 patienter) (Gse62080 och gse72970). För dessa tre studier var inklusionskriterier: histologiskt bevisat kolon adenokarcinom, avancerad och tvådimensionellt mätbar tumör (steg IV), ålder mellan 18 och 75 år och Världshälsoorganisationens (WHO) prestationsstatus 2. Före någon behandling genomgick alla patienter operation för primär tumörresektion eller endoskopisk biopsi.

för western blot-analys användes ytterligare 13 tumörprover från den prospektiva single-center-studien REGP men inte inkluderade i de 143 proverna.

för immunhistokemianalys valdes vävnadsprover från 52 ytterligare patienter med CRC retroaktivt från Institute of Cancer Research of Montpellier pathology files endast när normala slemhinnor, adenom och adenokarcinomprover var tillgängliga för samma patient.

alla studier med humana vävnadsprover godkändes av relevanta etikutskott och alla deltagare informerades om Studiens mål och metoder och undertecknade ett skriftligt informerat samtycke före inskrivning.

genuttrycksanalys

Kolonprover (normala kolon -, primärtumör-och levermetastasprover för REG/P-studien, men endast primära tumörprover för cosival-och BIOCOLON-studierna) samlades vid operationen efter ett standardiserat förfarande för att erhålla högkvalitativt RNA . Prover hybridiserades sedan till humant genom U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

för att identifiera nya terapeutiska mål för antikroppsbaserad terapi i mCRC jämförde vi genuttrycksprofilerna för normal slemhinna (n = 17), primär tumör (n = 20) och levermetastaser (n = 19) vävnadsprover.

eftersom CRC-heterogenitet måste beaktas vid jämförelse av genuttrycksprofiler klassificerades primära tumörprover (n = 143) med hjälp av CRC-molekylklassificeringar baserade på genuttrycksprofiler som har föreslagits av tre oberoende grupper och den senaste konsensusklassificeringen . I korthet, de Sousa E. Melo et al. föreslagna att gruppera tumörer i tre klasser: CCS1 (CRC med mikrosatellitinstabilitet, MSI), CCS2 (cancer med kromosomal instabilitet, CIN) och CCS3 (ny subtyp) . Sadanandam et al. identifierade fem molekylära subtyper, baserade på cellfenotypen: Bägarliknande, Transiteringsförstärkande (TA), Enterocyt, stamliknande och inflammatorisk . Marisa et al. beskrivna sex molekylära subtyper (C1 till C6) med följande huvuddrag: C1 = CIN och nedreglering av immunvägar, C2 = MSI, C3 = muterad KRAS, C4 = stamcellsfenotypliknande, C5 = CIN och uppreglering av WNT-vägarna och C6 = CIN och normalliknande genuttrycksprofil . Slutligen, från sex tidigare publicerade signaturer, presenterade ett internationellt konsortium en klassificering med fyra konsensusundertyper: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolic (CMS3) och mesenkymal (CMS4) (för granskning ). CRC – provfördelningen enligt molekylär subtyp visas i ytterligare fil 1: Tabell S1.

Immunohistokemianalys

prover samlades i en vävnadsmikrogrupp (TMA) med användning av tre vävnadskärnor (0,6 mm diameter vardera) som tidigare beskrivits . I korthet avparaffiniserades och rehydratiserades 3-oc-m-sektioner av TMA i graderade alkoholer. Värmeinducerad antigenhämtning utfördes genom inkubering av TMA-sektioner i EDTA-Buffert (pH 9) vid 98 20 C i ett vattenbad under min. Efter neutralisering av den endogena peroxidasaktiviteten inkuberades TMA-sektioner med en polyklonal anti-CLDN1-antikropp (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA) eller antikroppsutspädningsmedel (Dako, Glostrup, Danmark) ensam i 60 minuter. Primär antikroppsbindning visualiserades med hjälp av Envision-systemet och Dako Autostainer-systemet (dako, Glostrup, Danmark). Andelen CLDN1-positiva celler och färgningsintensiteten (0, ingen färgning; 1, gulaktig; 2, brun; och 3, mörkbrun) utvärderades för varje enskild TMA-plats.

Western blot-analys

Tumörvävnadsprover från patienter maldes direkt i lysbuffert (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM natriumortovanadat, en cocktailproteashämmare tablett för 10 ml) med användning av en mixer Mill 600 mm mm enhet (QIAGEN, Valencia, ca). Proteinkoncentrationen bestämdes med Bradford-analysen (Pierce Coomassie Plus proteinanalys). Därefter löstes 50 occurg av totala proteiner med 12% SDS-sida och överfördes till nitrocellulosamembran (Whatman Occursy Protran occursy, porstorlek 0,45 occursym). Icke-specifika bindningsställen blockerades med 5% (wt/vol) fettfri mjölk i PBS med 0,1% (vol/vol) Tween 20 (PBS-T) vid rumstemperatur under 1 h och sedan inkuberades membran vid 4 CB med en polyklonal anti-CLDN1-antikropp (JAY-8) över natten. Membran tvättades sedan och inkuberades med lämplig pepparrotperoxidas-konjugerad sekundär antikropp under 1 h. uppenbarelse utfördes med ett kemiluminescenssystem (Amersham Biosciences); för normalisering användes uttrycket av tubulin.

subcellulär proteinextraktion

proteinextraktion utfördes som tidigare beskrivits . För varje prov skars 20-oC-m tjocka sektioner med en kryotom, blandades i flytande kväve och maldes försiktigt med en mikropestel. För subcellulär proteinutvinning användes ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit enligt tillverkarens instruktioner (Calbiochem). Subcellulära fraktioner (10 UKG/vardera) laddades på 12% SDS-SIDGELER. Immunoblotting gjordes som beskrivet ovan med följande primära antikroppar: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Histon H3 (Pierce) och-Xiaomi-tubulin (Sigma T4026).

cellinjer

följande humana CRC-cellinjer användes: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (en gåva från C. Montagut, Institutionen för medicinsk onkologi, Hospital del Mar, Barcelona, Spanien), HCT116 (CCL-247) och ls174t (ATCC cl-188). För att erhålla den CLDN1-positiva SW480-cellinjen (SW480-CLDN1) transfekterades SW480-celler stabilt med den humana CLDN1-cDNA-klonen (Invitrogen MGC-samling) eller med Tom vektor (pcDNA) med hjälp av jetPRIME Kazaki transfektionsreagens (Polyplus-transfection Inc., Frankrike). CLDN1-positiva kloner valdes genom att odla transfekterade celler i närvaro av 500 Bac/ml geneticin. För cldn1-tystnad omvandlades SW620 med pSIREN-vektorn innehållande shRNA mot CLDN1 (SW620shCLDN1) eller mot luciferas (shLUC, negativ kontroll). Efter 24 timmar valdes celler med 1 occurg / mL puromycin och stabila kloner poolades. Alla transienta transfektioner gjordes med hjälp av jetPRIME Kazaki transfektionsreagens.

produktion av anti-CLDN1 mAb 6 F6

för antikroppsproduktion utmanades 6-8 veckor gamla kvinnliga BALB/c-möss (Harlan, Gannat, Frankrike) genom intra-peritoneal (IP) injektion av 4 miljoner mus NIH-celler transient transfekterade med CLDN1 cDNA (NIH-CLDN1-celler) varannan vecka (totalt fem injektioner). NIH-CLDN1-celler blandades med komplett Freunds adjuvans (Sigma) för den första injektionen och med ofullständigt Freunds adjuvans (Sigma) för de andra fyra injektionerna. En intravenös boosterinjektion av NIH-CLDN1-celler gavs tre månader efter den femte immuniseringen. Tre dagar senare smältes mjältceller från immuniserade möss med myelomcellinjen P3-X63-Ag.8.653 för att producera mushybridomer. Supernatanter från nybildade kloner screenades genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med SW480-CLDN1-och SW480-celler (negativ kontroll). Screeningsresultaten bekräftades genom att utföra och ytterligare screening med SW620-och SW620-shCLDN1-celler. Anti-CLDN1 hybridoma 6 F6-klonen valdes och klonades genom att begränsa utspädningen. Antikroppsisotypning visade att 6 F6 var en IgG3k.

alla djurförsök utfördes i enlighet med de franska regeringens riktlinjer för experimentella djurstudier (avtal CEEA-LR-12052).

radiomärkning och SPECT-CT-avbildning

kvinnliga athym nakna möss (6-8 veckor gamla) köptes från Harlan. 6 F6 mAb radiomärktes med 125i (Perkin Elmer) vid den specifika aktiviteten på 370 MBq/mg för enfotonemission beräknad tomografi (SPECT) avbildning, med hjälp av JODGENEN (Pierce Chemical Co.) sätt. Efter svansveninjektion av 16 MBq / 50 occurg 125i-märkt 6 F6, helkropps-enkelfotonemissionstomografi/datortomografi (SPECT/CT) bilder förvärvades med en 4-huvud multiplexering Multi-pinhole NanoSPECT-kamera (Bioscan Inc., Washington, USA) vid olika tidpunkter (48, 72 och 96 h). Samtidigt förvärvades mikro-CT-bilder i hela kroppen för anatomisk samregistrering med SPECT-data. Rekonstruerade SPECT-och CT-data visualiserades och samregistrerades med hjälp av invivoscope VIII.

Klonogenisk analys

kolorektala cancerceller såddes i en 6-brunnsplatta (150, 250 eller 400 celler/brunn) och fick klibba vid 37 kcal C över natten. Sedan tillsattes 1 ml RPMI med eller utan 6 F6 mAb (slutkoncentration: 100 oc/ml) till varje brunn och celler odlades i sex dagar. Efter ytterligare sex dagar i medium utan antikropp lästes plattor med användning av en Celigo-bildcytometer och applikationen” single colony verification”. Celigo cytometer är ett cellanalyssystem in situ som ger bilder av brunnar med ljusfältbelysning (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

etablering av tredimensionella (3D) sfäroidkulturer

Ultra-låg fastsättning, rundbotten 96-brunnsplattor (Corning Costar) användes för sfäroidbildning. SW480 -, SW480-CLDN1-eller SW620-celler såddes vid en densitet av 5-104-xnumx-xnumx-xnumx-xnumx-xnumx-xnumx-xnumx-xnumx. Celler aggregerade och slogs samman i 3D-sfäroider inom 24-72 h. Bilder av brunnar togs med ett faskontrastmikroskop med användning av ett 5-mål för kakor eller fångades med Celigo-bildcytometern för kakor med användning av applikationen “Tumörosfär”. Cellviabilitet bedömdes med Celltiter-Glo luminescerande Cellviabilitetsanalys (Promega, Madison, WI, USA). Efter tillsats av 100 occyl CellTiter Glo-reagens till varje brunn i 10 min mättes luminiscens på en 1450 MicroBeta TriLux luminiscens mikroplattläsare (Perkin Elmer).

cellcykel och proliferationsanalys i sfäroider

sfäroider framställdes genom plätering av 1000 DiFi-celler per brunn i ultralåga fäst 96-brunnsplattor och odling av dem i närvaro av 100 MGG/ml av 6 F6 mAb eller irrelevant mAb (retuximab) i 5 dagar. För cellcykelanalys pelleterades celler, trypsiniserades, tvättades med PBS, fixerades i 75% etanol och färgades med 40 kg/ml propidiumjodid i närvaro av 100 kg ml−1 RNAs (Qiagen). Cellcykelfördelningen bestämdes med en Fc500 Beckman Coulterflödescytometer med användning av FL-3-kanalen. Celler var gated på en punktplott som visade DNA-puls-topp vs DNA-pulsområdet för att utesluta dubbletter. Cellcykelfördelningar illustrerades med hjälp av Flow Jo-analysprogramvaran (Treestar, FLOWJO, Ashland eller USA).

vid Dag 4 av odling mättes cellproliferation genom inkubering av celler med 5-etynyl-2′-Deoxyuridin (EdU) i 24 timmar. EdU införlivas i DNA under aktiv DNA-syntes. Sedan, efter cell trypsinisering och fixering/permeabilisering i 75% etanol/PBS, inkorporerades EdU märkt och detekterades med Click-iT EdU Alexa Fluor 488 flödescytometri Assay Kit (Invitrogen). Celler inkuberades sedan med 1 kg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i PBS/0,1% Triton X100 vid 37 C i 30 minuter. Celigo-applikationen “Expression Analysis” (Target 1 + Mask) användes för att kvantifiera den fluorescerande signalen och för dataanalys. Celler identifierades med användning av DAPI-kärnfläcken och DNA-syntesen kvantifierades genom mätning av EdU-inkorporering.

Mouse xenograft-modeller

1,5 kg 106 SW620-celler eller 3 kg 106 DiFi-celler suspenderades i odlingsmedium och injicerades subkutant (s.c.) i den högra flanken av 6-8 veckor gamla kvinnliga athym-nakna möss från Harlan. När tumörvolymen nådde cirka 100 mm3 randomiserades möss i olika grupper och behandlades med IP-injektion av 0,9% NaCl eller 6F6 mAb (15 mg/Kg per injektion) två gånger i veckan i tre på varandra följande veckor för det första experimentet och tre gånger i veckan för det andra experimentet. Tumörer mättes varannan vecka med en tjocklek och volymer beräknade med formeln: D1 x D2 x D3/2.

Intrasplenisk leverkoloniseringsmodell

i varje experiment injicerades 2 miljoner luciferas-Uttryckande SW620-celler (SW620-LUC-celler) i mjälten hos 6-8 veckor gamla kvinnliga athymiska nakna möss. Mjälten avlägsnades 2 min efter cellinjektion. På dag 1 efter injektion delades möss slumpmässigt i två grupper om 10 möss som behandlades antingen med 15 mg/kg 6 F6 mAb eller 0,9% NaCl genom IP-injektion, tre gånger per vecka. För att utvärdera metastatisk bildning och spridning övervakades luciferasuttryck genom luminiscensavbildning efter injektion av luciferin (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer bisexuell) en gång per vecka. Vid vecka 5 Efter operationen offrades möss, lever avlägsnades, fotograferades och makroskopiskt synliga metastaser på leverytan räknades.

statistisk analys

statistisk analys gjordes med hjälp av Stata 13.0-programvaran (StataCorp). För genuttryck eller immunhistokemiexperiment analyserades skillnader mellan grupper med hjälp av Kruskall Wallis/Dunns test. Korrelationer mellan cldn1-genuttryck och progressionsfri överlevnad (PFS) och total överlevnad (OS) utvärderades i hela gruppen (n = 143 patienter) och enligt tumörmolekylär subtyp. För detta ändamål delades de 143 patienterna i två grupper baserat på median cldn1-genuttryck (dvs 9, 75 ). PFS-och OS-värden jämfördes med Kaplan-Meier-metoden och skillnader mellan överlevnadsfördelningar bedömdes med log-rank-testet.

det parade t-testet användes för att jämföra effekten av inkubation med 6 F6 mAb i in vitro-experiment.

i in vivo-experiment användes en linjär blandad regressionsmodell för att bestämma förhållandet mellan tumörtillväxt och antal dagar efter injektion. Den fasta delen av modellen inkluderade variabler som motsvarar antalet postgraftdagar och olika behandlingsgrupper. Interaktionsvillkor byggdes in i modellen; slumpmässiga avlyssningar och slumpmässiga sluttningar inkluderades för att ta hänsyn till tidseffekten. Koefficienterna för modellen uppskattades med maximal sannolikhet. Överlevnadsgraden uppskattades från injektionsdatumet till det datum då tumören nådde en volym på 1500 mm3 med Kaplan–Meier-metoden. Överlevnadskurvor jämfördes med log-rank-testet. För leverkoloniseringsexperimenten utvärderades skillnader mellan grupper med Mann-Whitney U-testet. För alla experiment ansågs skillnader vara signifikanta när P < 0,05.