cis-trans isomeras av omättade fettsyror i Pseudomonas och Vibrio: biokemi, molekylärbiologi och fysiologisk funktion av en unik spänningsadaptiv mekanism

Abstrakt

isomerisering av cis till transomättade fettsyror är en mekanism som gör det möjligt för gramnegativa bakterier som tillhör släktena Pseudomonas och Vibrio att anpassa sig till flera former av miljöstress. Isomeriseringens omfattning korrelerar tydligen med de fluiditetseffekter som orsakas, dvs genom en ökning i temperatur eller ackumulering av membrantoxiska organiska föreningar. Transfettsyror genereras genom direkt isomerisering av respektive cis-konfiguration av dubbelbindningen utan förskjutning av dess position. Omvandlingen av cis-omättade fettsyror till trans är uppenbarligen avgörande för anpassningen av membranfluiditet till förändrade kemiska eller fysiska parametrar i den cellulära miljön. En sådan adaptiv mekanism verkar vara ett alternativt sätt att reglera membranfluiditeten när tillväxten hämmas, t.ex. av höga koncentrationer av giftiga ämnen. Cis-trans-isomeras(Cti) – aktiviteten är konstitutivt närvarande och ligger i periplasma, den kräver varken ATP eller någon annan kofaktor såsom NAD (P)H eller glutation, och den fungerar i frånvaro av de novo-syntes av lipider. Dess oberoende från ATP överensstämmer med reaktionens negativa fria energi. cti kodar en polypeptid med en N-terminal hydrofob signalsekvens, som klyvs av under eller kort efter att enzymet transporteras över det cytoplasmiska membranet till det periplasmiska utrymmet. En funktionell hembindningsplats för cytokrom c-typ identifierades i den förutsagda Cti-polypeptiden och mycket nyligen erhölls direkta bevis för att isomerisering inte innefattar en övergående mättnad av dubbelbindningen.

1 Introduktion — historia

i alla levande celler påverkar stress på grund av rigorösa förändringar i miljön membranen. Som ett resultat uppstår störning av membranintegritet och följaktligen äventyras funktionen som en barriär, som en matris för enzymer och som en energiomvandlare . Om motåtgärder inte vidtas tillväxthämning eller till och med celldöd kan uppstå. Det huvudsakliga adaptiva svaret hos cellerna är att hålla fluiditeten hos deras membran vid ett konstant värde oavsett faktiska miljöförhållanden. Sådan stabilisering av membranfluiditet känd som’ homeoviskös anpassning ‘ åstadkommes genom förändringar i fettsyrasammansättningen av membranlipider, det utgör bakteriens övervägande svar på membranaktiva ämnen eller förändrade miljöförhållanden . Denna grundläggande mekanism undersöktes och rapporterades i det berömda arbetet av Ingram i slutet av 70-talet av förra seklet . Men fram till slutet av 80-talet ansågs cis-konfigurationen av dubbelbindningen fortfarande vara den enda som förekommer naturligt i bakteriella fettsyror. Förbättringen av analytiska skärningstekniker, särskilt genom att införa kapillärkolonner i gaskromatografi, underlättade tydlig differentiering av relaterade fettsyrametylestrar och en ny klass av fettsyror, dvs trans-konfigurerade omättade fettsyror, hittades i vissa prokaryoter . De första rapporterna om transisomerer av omättade fettsyror var för Vibrio och Pseudomonas för bara 10 år sedan. Det kunde då påvisas att transomättade fettsyror syntetiserades in vivo från acetat i Pseudomonas atlantica, även om det, baserat på kända biosyntetiska vägar för omättade fettsyror, inte fanns någon förklaring möjlig hur sådana fettsyror kunde bildas.

kort efter det visades att omvandling av cis till transomättade fettsyror utgör en ny adaptiv mekanism som gör det möjligt för bakterier att ändra sin membranfluiditet hos två arter, dvs. i den psykrofila bakterien Vibrio sp. stam ABE-1 som svar på en ökning av temperaturen och i Pseudomonas putida P8 som anpassning till giftiga organiska föreningar, såsom fenoler .

vår minireview sammanfattar nuvarande kunskap och framsteg om ämnets tillstånd och lägger tonvikten på en ganska effektiv och elegant mekanism som gör det möjligt för bakterier att anpassa sig till miljöförändringar som påverkar membranfluiditeten.

2 fysiologi och funktion av cis–trans isomeras (Cti) av omättade fettsyror

båda, i Vibrio sp. stam ABE – 1 och i P. putida P8, en tydlig ökning av den normalt låga mängden transomättade fettsyror observeras när celler utsätts för förhöjda temperaturer eller toxiska fenolkoncentrationer. Växande celler av P. putida reagerar på fenol på ett koncentrationsberoende sätt, d .v. s. ökning av trans och samtidig minskning av respektive cis omättade fettsyror korrelerar med mängden fenol ackumulerad i membranet. Sådan omvandling är inte beroende av tillväxt eftersom den också förekommer i icke-växande celler där förhållandet mellan mättade och omättade fettsyror och den totala mängden omättade fettsyror inte kan ändras på grund av bristen på lipidbiosyntes . Konsekvent sker reaktionen i celler där fettsyrabiosyntes hämmas av cerulenin . Cis-trans-omvandling har en enzymliknande kinetik och når sitt slutliga trans till cis-förhållande 30 min efter tillsats av membrantoxiska medel. Eftersom omvandlingshastigheten inte påverkas av kloramfenikol drogs slutsatsen att systemet är konstitutivt närvarande och inte kräver de novo-proteinbiosyntes .

oljesyra (C18:1 ACC.9cis), som normalt inte syntetiseras av P. putida P8, införlivas emellertid i membranlipider i kompletterade kulturer. Efter tillsatsen av en toxisk 4-klorfenolkoncentration omvandlades oljesyra till dess transisomer, dvs elaidinsyra (C18:1 kaukasus9trans). Ett sådant resultat visade att transfettsyror syntetiseras genom direkt isomerisering av cis till transomättade fettsyror utan att förskjuta dubbelbindningens position . Ökningen av de transomättade fettsyrorna åtföljdes av minskningen av respektive cis-omättad fettsyra, medan den totala mängden av båda hölls konstant vid vilken koncentration som helst av tillsatta toxiner . Systemet kräver inte ATP eller någon annan kofaktor som NAD(P)H eller glutation. Dess oberoende från energi som ger ATP är i enlighet med den negativa fria energin från cis till trans-reaktionen .

alla dessa data ledde till förslaget om cis–trans isomerisering är ett nytt adaptivt svar i bakterier som gör det möjligt för dem att hantera ökningar i temperatur eller toxiska koncentrationer av membranstörande föreningar, förhållanden som annars skulle påverka deras membranfluiditet .

fördelen med omvandlingen härrör från steriska skillnader som visas av cis och transomättade fettsyror. Ett högt innehåll av mättade fettsyror i membran gör det möjligt för acylkedjorna av fettsyror att bilda en optimal hydrofob interaktion mellan varandra, vilket så småningom leder till ett tätt packat, styvt membran. I allmänhet har mättade fettsyror en mycket högre övergångstemperatur eller smältpunkt jämfört med cis-omättade fettsyror. Fosfolipider som innehåller 16:0 mättade fettsyror har en övergångstemperatur som är ca 63 C C högre än de som innehåller 16: 1 cis omättade fettsyror . Fasövergångstemperaturen hos membran ökar med ökande förhållanden av mättade till omättade fettsyror. Dubbelbindningen av en cis-omättad fettsyra framkallar en orörlig böjning med en vinkel på 30 kcal i acylkedjan. Följaktligen störs det högt ordnade paketet av acylkedjor i membranen, vilket i sin tur resulterar i lägre fasövergångstemperaturer hos sådana membran . Således resulterar omättade fettsyror i cis-konfigurationen med böjda steriska strukturer (dvs en kink i acylkedjan) i ett membran med relativt hög fluiditet. I markerad kontrast saknar den långa förlängda steriska strukturen hos trans-konfigurationen kinken och kan infoga i membranet på samma sätt som mättade fettsyror .

bakterier anpassar sig till en ökning av deras membranfluiditet genom att öka mättnadsgraden av deras fosfolipidfettsyror och i vissa fall byta från cis till trans konfigurationen av deras omättade fettsyror. . En stor nackdel med förändringar i mättnadsgraden som ett stressrespons härstammar från dess strikta beroende av celltillväxt och fettsyrabiosyntes. Följaktligen kan bakterier som använder denna mekanism inte utföra post-biosyntetiska modifieringar av deras membranfluiditet. Det har faktiskt observerats att lösningsmedel orsakar en förändring i förhållandet mellan mättade och omättade fettsyror endast upp till koncentrationer som fullständigt hämmar tillväxten. I närvaro av högre, dvs toxiska, koncentrationer kan cellerna inte reagera och kan således inte anpassa sig till sådana förhållanden eller de dör till och med . Isomeriseringen av cis till transomättade fettsyror som hittills bara finns i stammar av släktet Pseudomonas, inklusive de stora representanterna P. putida och P. aeruginosa och Vibrio representerar en lösning på problemet med tillväxtberoende eftersom det också fungerar i icke-växande celler. Även om förändringen från cis till den transomättade dubbelbindningen inte har samma minskande effekt på membranfluiditet som en omvandling till mättade fettsyror orsakar det fortfarande en väsentlig effekt på membranets styvhet .

efter första observationer huvudsakligen baserade på fenolföreningar testades en serie organiska lösningsmedel för deras förmåga att aktivera Cti, kvalitativt och kvantitativt. Följaktligen korrelerar graden av isomerisering tydligen med toxiciteten och koncentrationen av organiska föreningar i membranet . Lösningsmedlets antimikrobiella verkan korrelerar med dess hydrofobicitet på ett sätt som uttrycks av logaritmen för föreningens Fördelningskoefficient i en blandning av n-oktanol och vatten (logPow) . Organiska lösningsmedel med en logPow mellan 1 och 5 är mycket giftiga för mikroorganismer eftersom de partitionerar företrädesvis i membran, där de orsakar en ökning av membranfluiditet, vilket slutligen leder till icke-specifik permeabilisering . Förhållandet mellan logP-värdet för en förening och dess toxicitet visas i Tabell 1, där 11 undersökta föreningar listas enligt deras ökande logP-värden. I Fig. 1 logP-värdena plottas mot uppmätta uppskattade koncentrationer som orsakar 50% tillväxthämning (EC 50) och samtidigt koncentrationerna av föreningarna som orsakar en halv maximal ökning av trans/cis (TC 50)-förhållandet mellan bakterier. Således finns det ett direkt samband mellan toxiciteten hos organiska lösningsmedel och deras aktiveringseffekter på Cti, men detta är helt oberoende av föreningarnas kemiska strukturer.

sedan 1989, när en P. putida-stam upptäcktes som växte i media innehållande en andra fas av den allmänt mycket toxiska toluen, styren eller xylen, flera andra P. putida-stammar har hittats med liknande egenskaper , och många forskargrupper har försökt avslöja mekanismerna bakom lösningsmedelstolerans. I de flesta av dessa bakterier har Cti varit involverad i lösningsmedelstolerans.

inte bara organiska lösningsmedel eller temperaturökning utan också några andra spänningselicitorer testades för deras effekt på Cti. Sammanfattningsvis visade sig alla membran som påverkar stimuli såsom organiska lösningsmedel, osmotisk stress (orsakad av NaCl och sackaros), tungmetaller, värmechock och membranaktiva antibiotika aktivera systemet . Stressförhållanden, såsom osmotisk stress orsakad av glycerol, kall chock och högt pH, som är kända för att inte vara aktivatorer av cellulärt K+-upptag — den första cellulära reaktionen på membranskador som leder till ökad permeabilisering — orsakade inte aktivering av Cti . Sådana fynd tyder tydligt på att cis/trans-förhållandet förmodligen är en del av en allmän stressresponsmekanism hos mikroorganismer .

3 biokemi och molekylärbiologi av Cti

efter den fysiologiska beskrivningen av CTI: s övergripande funktion i bakterier för att anpassa sig till olika påfrestningar utfördes molekylärbiologiska och biokemiska undersökningar för att karakterisera detta unika adaptiva responssystem.

baserat på tester av CTI-aktivitet i cellfack betraktades det cytoplasmatiska membranet som platsen för enzymet där även dess substrat, fosfolipidfettsyrorna, är närvarande. Överraskande renades emellertid Cti från den periplasmiska fraktionen av Pseudomonas oleovorans och Pseudomonas sp. stam E-3 . Kloning av enzymet tillät dess isolering som ett His-taggat P. putida P8-protein heterologt uttryckt i Escherichia coli. Cti är ett neutralt protein av 87 kDa och visade sig vara monokistroniskt transkriberat och konstitutivt uttryckt. Nukleotidsekvensen för CTI-genen från P. putida P8, P. putida DOT-T1E och P. oleovorans Gpo12 visade slutligen att isomeras har en N-terminal hydrofob signalsekvens, som klyvs av efter att ha riktat enzymet till det periplasmiska utrymmet.

en CTI knockout mutant av P. putida DOT-T1E har konstruerats som inte kan isomerisera cis omättade fettsyror. Denna mutant har en överlevnadshastighet när den är chockad med 0.08% (vol/vol) toluen lägre än vildtypsstammen, och det visar också en längre fördröjningsfas än föräldrastammen när den odlas med toluen som levereras i gasfasen , resultat som tydligt implicerar Cti i toluensvar i denna stam. Cis-trans-isomeriseringen är emellertid osannolikt att vara den enda nödvändiga anpassningsmekanismen till organiska lösningsmedel eftersom stammar är kända som kan utföra isomeriseringen och fortfarande är lösningsmedelskänsliga .

Holtwick et al. tillhandahöll bevis för att enzymet är ett cytokrom C-typprotein eftersom de kunde hitta ett hembindningsställe i den förutsagda Cti-polypeptiden. För ett enzympreparat från Pseudomonas sp. stam E-3, som förmodligen är homolog med CTI-genprodukten av P. putida P8, föreslogs att järn (förmodligen Fe3+) spelar en avgörande roll i den katalytiska reaktionen . Cis-trans-isomerisering befanns vara oberoende av kardiolipinsyntas, ett enzym som underlättar långvarig anpassning av membranet genom förbättrad kardiolipinsyntes .

mycket nyligen belystes den molekylära mekanismen för isomeriseringsreaktionen. I kompletteringsexperiment med dubbel deutererad oljesyra visades att oljesyra omvandlades uteslutande till dubbel deutererad elaidsyra efter aktivering av Cti. En övergående mättnad av dubbelbindningen under isomerisering måste uteslutas såväl som en kopplad hydrering–dehydreringsreaktion . Således föreslås en enzymatisk mekanism: ett enzym-substratkomplex bildas i vilket det elektrofila järnet (förmodligen Fe3+), som tillhandahålls av hemdomänen närvarande i enzymet, avlägsnar en elektron från cis-dubbelbindningen och överför sp2-länkningen till en sp3. Dubbelbindningen rekonstitueras sedan efter rotation till trans-konfigurationen. Ett schema för denna föreslagna enzymatiska mekanism presenteras i Fig. 2. En sådan mekanism är i enlighet med platsstyrda mutagenesexperiment utförda för att förstöra det hembindande motivet I Cti av P. putida P8 . Dessa mutationer resulterar i förlust av enzymets funktion och ger således bevis för närvaron av cytokrom c och hem i enzymets katalytiska centrum. Eftersom enzymets reaktion inte beror på en kofaktor skiljer sig Cti-aktivitet från alla andra kända heminnehållande enzymer som verkar på fettsyror som substrat. Det finns dock inget behov av en kofaktor eftersom ingen nettoelektronkraft förbrukas.

en annan indikation för dess unika härrör från likhetssökningar: Cti visade inga signifikanta likheter med homologa peptider när den förutsagda aminosyrasekvensen jämfördes med andra proteiner. Inte överraskande identifierade emellertid jämförelse av aminosyrasekvenser av de sju upp till de nuvarande kända Cti-proteinerna dem alla som heminnehållande polypeptider av cytokrom c-typen . Oavsett taxon är en hemgrupp av cytokrom c-typ närvarande som ett mycket konserverat motiv och som en funktionell domän i alla enzymer jämfört , i synnerhet är hembindningsstället i Cyt c-proteiner beläget mellan hemvinylgrupper och de två cysteinerna som finns i det konserverade hembindande motivet CXXCH.

i alla CTI-sekvenser av de sex Pseudomonas-stammarna som hittills undersökts finns en N-terminal signalsekvens närvarande, vilket indikerar den periplasmiska lokaliseringen av Cti. En sådan lokalisering har redan bevisats för P. oleovorans och P. putida DOT-T1E . Emellertid är en signalpeptidkarakteristik för Sec-beroende utsöndring inte närvarande i Cti-proteinet av V. cholerae. Flera sekvensinriktningar av de sju kända Cti-proteinerna avslöjade att proteiner från Pseudomonas-och Vibrio-stammar bildar ett fylogenetiskt träd bestående av tre huvudgrenar, vilket tyder på en gemensam förfader till enzymet. Intressant är att den förutsagda polypeptiden från V. cholerae uppenbarligen inte utgör en separat grupp utan snarare härrör från den olika gruppen av proteiner från P. aeruginosa och P. sp. E-3 . Mycket nyligen avslöjade anpassningsstudier att gener som är bekanta med cti också kan vara närvarande i genomerna av bakterier som tillhör släktena Methylokocker och Nitrosomonas. Dessa organismer är också kända för att innehålla transomättade fettsyror . Men direkta fysiologiska eller biokemiska bevis för närvaron av Cti i dessa bakterier saknas fortfarande.

4 reglering av Cti

en av de stora öppna frågorna angående CTI för omättade fettsyror är hur aktiviteten för detta konstitutivt uttryckta periplasmiska enzym regleras. En möjlighet skulle vara en komplex modell där substraten av enzymet, cis-omättade fettsyror, klyvs bort från den periplasmiska fasen av membranfosfolipiderna. Den resulterande fria omättade fettsyran skulle sedan isomeriseras genom Cti-verkan och därefter fästas på lysofosfolipiden, vilket resulterar i en fosfolipid innehållande transomättade fettsyror . Ändå är en sådan komplex modell inte överens med data som bekräftar Cti-aktivitet i vilande celler och i fullständig frånvaro av energikällor , eftersom åtminstone återfästningen av de modifierade fettsyrorna till membranet skulle behöva energi.

reglering av enzymaktivitet kan emellertid åstadkommas genom att helt enkelt ge enzymets aktiva centrum förmågan att nå sitt substrat, dubbelbindningen, som i sin tur beror på membranets fluiditetstillstånd. Följaktligen återspeglar den observerade regio-specificiteten hos enzymet penetrering av isomeras aktiva plats till ett specifikt djup i membranet . Den hydrofila strukturen av Cti och dess periplasmiska läge stöder antagandet att enzymet endast kan nå sitt mål, dvs. de dubbelbindningar av omättade fettsyror som är belägna vid ett visst djup av membranet, när membranet är ‘öppnas’ av miljöförhållanden som orsakar en sönderdelning av membranet . Det har tidigare visats att en minskning av acylkedjeordning kan resultera i ökad penetration och translokation av proteiner i membran . I analogi med vissa fosfolipaser är det tänkbart att Cti visar djupare penetration i membranet när beställningen av acylkedjor minskas och avståndet mellan fosfolipidhuvudgrupper ökas. Det är också tydligt tänkbart att minskning av membranpackningen skulle tillåta dubbelbindningar att närma sig membranytor oftare , vilket i slutändan underlättar interaktion med isomeras . Eftersom acylkedjepackningen ökas genom cis till trans isomerisering av de omättade fettsyrorna , skulle penetrationen av proteinet motverkas och samtidigt inhiberas cis till trans isomerisering, vilket så småningom resulterar i tät reglering av acylkedjepackningen utan inblandning av indirekta signaleringsmekanismer eller vägar. Efter avlägsnande av den membranaktiva föreningen sker återvinning av det regelbundet låga trans-cis-förhållandet sannolikt genom normal de novo-syntes av all-cis-fettsyror, eftersom den omvända (trans till cis) – processen skulle kräva en energiinmatning.

en sådan modell för reglering av Cti–aktivitet förklarar också tillräckligt det ofta rapporterade förhållandet mellan graden av cis-trans-isomerisering och toxiciteten orsakad av en viss koncentration av en miljöstressfaktor . Som ett annat resultat av reaktionen katalyserad av enzymet sker en minskning av membranfluiditeten och eftersom enzymet inte kan nå sitt mål när membranfluiditet har nått sin normala nivå tvingas enzymet ut ur dubbelskiktet .

5 avslutande anmärkningar

även om cis–trans-isomerisering av omättade fettsyror inte har förstått fullständigt blev det uppenbart att det är en del av ett allmänt stressresponssystem i Pseudomonas och Vibrio-celler. En annan indikation för CTI: s allmänna funktion är också dess ofta beskrivna beroende av induktion/aktivering av andra stressresponsmekanismer .

uppenbarligen utgör den en brådskande adaptiv mekanism som möjliggör snabba modifieringar av membran för att hantera den framväxande miljöbelastningen. Ett sådant snabbt svar, som verkar i form av minuter, ger tid för andra mekanismer beroende på celltillväxt för att underlätta deras roll i det adaptiva svaret, eftersom den omedelbara reaktionen garanterar överlevnad under olika stressförhållanden. När det gäller lösningsmedelstolerans arbetar en slags kaskad av snabba (brådskande), halvtids-och långsiktiga mekanismer uppenbarligen tillsammans för att nå en fullständig anpassning till miljöstress. Cti representerar utan tvekan ett av de stora brådskande systemen som hjälper cellerna att motstå den första toluenchocken, så småningom möjliggör aktivering och induktion av ytterligare adaptiva mekanismer som slutligen provocerar den fullständiga anpassningen .

på grund av dess enkla funktion och effektivitet och eftersom det fungerar utan komplexa regler är det fantastiskt att en sådan cis till trans isomeriseringsmekanism inte är allestädes närvarande i gramnegativa bakterier. En möjlig förklaring kan komma från den utbredda förekomsten av de två släktena Pseudomonas och Vibrio. Bland icke-specialiserade bakterier är medlemmar av släktet Pseudomonas kända för att vara mycket anpassningsbara mikroorganismer, efter att ha erövrat alla nischer i ett stort antal ekosystem som omfattar jord, mänsklig hud och havsvatten. Medlemmar av släktet Vibrio erövrade också ett brett spektrum av ekosystem, inklusive mark och djuphav. För att kunna kolonisera alla dessa nischer måste de vara extremt flexibla och anpassningsbara till förändrade miljöförhållanden. Cti ger cellerna en effektiv mekanism för att uppnå en sådan anpassningsförmåga. Detta krävs inte i andra gramnegativa bakterier, såsom E. coli, som är specialiserade på liv i mag-tarmkanalen hos däggdjur där de kan leva lyckligt utan en sådan brådskande membrananpassningsmekanism.

membranlipider erbjuder ett lovande verktyg som biomarkörer för analys av mikrobiella populationsförändringar. Faktiskt, Guckert et al. har föreslagit att använda ett trans / cis-förhållande större än 0.1 (normalt index rapporterat för de flesta miljöprover) som ett index för svält eller stress. Eftersom mätningen av fettsyraprofiler har blivit en rutinmetod i många laboratorier låter detta som ett lovande tillvägagångssätt för bedömning av toxiska effekter. Bestämningen av trans / cis-indexet kan således vara ett värdefullt alternativ för att studera toxicitetsstatus hos naturliga prover, särskilt när tillväxtberoende tester inte kan utföras, t.ex. i naturliga livsmiljöer. Det huvudsakliga användningsområdet för en sådan indikator verkar vara mätning av toxicitet och miljöstress Under in situ bioremedieringsprocesser där fettsyraprofiler har betydelse som markör för ekologiska undersökningar av markmikrofloran. Till exempel, under bioremediering av förorenade platser, kan nivån av transomättade fettsyror användas som en markör för allmän stress och stressreducering för att övervaka den biologiska nedbrytningsprocessen . Tillämpningen av cis–trans-isomeriseringen som ett bedömningsverktyg för den allmänna toxiciteten hos organiska föreningar har redan beskrivits för aromatiska karbonylföreningar . Ytterligare studier som syftar till och förbättrar användningen av isomerisering av cis till transomättade fettsyror som en indikator för stress är avgörande och kan i slutändan resultera i en tillämplig teknik för miljöövervakning.