Cistron
biogenes av PTX
de fem PTX-underenheterna kodas av angränsande cistroner inom en enda polycistronisk operon , vars uttryck regleras av BvgA/s-systemet. Via detta tvåkomponentsystem toxinproduktion kan moduleras genom närvaron av av MgSO4 eller nikotinsyra, eller under tillväxt vid låga temperaturer (för granskning, se ). BvgS är ett inre membran som spänner över protein som uttrycker flera kinasaktiviteter. I det aktiva tillståndet aktiverar det BvgA via fosforylering. Fosforylerad BvgA, en cytoplasmatisk transkriptionsregulator, binder sedan till operatörsställena i PTX-genpromotorregionen, där den interagerar med RNA-polymeraset och aktiverar transkription. Även om modulatorer som stör BvgS-signalering har identifierats, är ingen BvgS-ligand som krävs för att utlösa signalering känd, vilket tyder på att BvgS aktiveras som standard .
efter transkription produceras de enskilda underenheterna som preproteiner innehållande klyvbara signalpeptider. Vid translokation genom det inre membranet (troligen via en Sec-beroende väg) avlägsnas signalpeptiderna. Även om signalpeptiderna visar typiska egenskaper hos substraten för leader peptidas I, är deras klyvning av Escherichia coli leader peptidas i mycket ineffektivt. Coexpression av B. pertussis lep-genen i E. coli ökar väsentligt mognaden av PTX-subenheter . Inom det periplasmiska utrymmet bildas intra-subenhetsdisulfidbindningar och holotoxinet monteras sedan före utsöndring genom det yttre membranet. PTX innehåller totalt 11 intra-subenhetsdisulfidbindningar, en i S1, två i varje S4 och S5 och tre i varje S2 och S3 . Alla cysteiner som finns i PTX är involverade i disulfidbindningar inom kedjan . Disulfidbildningen är viktig för toxinbiogenesen, eftersom förändringen av antingen cystein i S1 förhindrar att denna subenhet monteras med B-oligomeren . Korrekt disulfidbildning är beroende av dsba / DsbC-systemet, vilket visade sig vara väsentligt för PTX-montering och utsöndring . Mutationer i dsbC, som kodar för en av tre disulfidisomeraser, har emellertid uppenbarligen ingen effekt på sammansättningen av toxinet, även om de försämrar dess utsöndring, vilket tyder på att DsbC verkar på en komponent som specifikt krävs för PTX-utsöndring.
sekretion krävs inte för biologiska aktiviteter av PTX, men full montering av holotoxinet är viktigt för effektiv utsöndring, eftersom stammar konstruerade för att producera endast S1 eller endast b-oligomeren visar en defekt i sekretion . En fullt funktionell B-oligomer kan emellertid utsöndras i viss utsträckning i frånvaro av S1 , vilket indikerar att närvaron av S1 inte är ett absolut krav på B-oligomersekretion. Däremot kan S1 ensam inte utsöndras i frånvaro av B-oligomeren, vilket tyder på att sekretionsdeterminanterna är belägna inom B-oligomeren, även om närvaron av S1 säkert kan förbättra sekretionseffektiviteten. Vissa mutationer i S1-genen har en stark skadlig effekt på utsöndring, särskilt i området runt Arg-57 , vilket tyder på att denna region av S1 spelar en roll i utsöndringen av PTX. I frånvaro av B-oligomeren, S1 mest sannolika partitioner till det yttre membranet, kanske via dess C-terminal, hydrofoba domän. Detta kan vara monteringsplatsen med B-oligomeren före utsöndring genom det yttre membranet .
de molekylära stegen i holotoxinaggregatet är fortfarande dåligt förstådda. Enstaka underenheter i mutanta stammar som inte producerar de andra underenheterna försämras snabbt. Vissa kombinationer av underenheter verkar ömsesidigt stabilisera varandra . Till exempel förbättras stabiliteten hos S2–subenheten kraftigt genom närvaron av S4 och vice versa, vilket överensstämmer med S2-S4-dimerbildningen som avslöjas av kristallstrukturen hos holotoxinet. Det är också möjligt att underenheter av S2–S4-dimeren med S1-underenheten bildas i frånvaro av S3 och S5. S2-S4-dimeren har inte visat sig utsöndras i B. kikhosta, medan tillsatsen av S1 till denna dimer kan resultera i en viss nivå av utsöndring.
transporten av PTX genom det yttre membranet av B. pertussis är beroende av ett typ IV-sekretionssystem (T4SS) som består av nio olika proteiner, namngivna PtlA genom PtlI . Dessa proteiner är homologa med de av T4SSs från andra bakterier, inklusive Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila och Rickettsia prowasekii . Ptl-generna ligger direkt nedströms om de fem strukturella PTX-generna och är under kontroll av ptx-promotorn . Ptl-proteinerna verkar emellertid produceras vid lägre nivåer än PTX-subenheterna, vilket framgår av translationella fusioner av phoA-genen med olika PTX-och ptl-gener . Produktionen av vissa PTL-proteiner verkar vara ett begränsande steg i utsöndringen av PTX. Under exponentiell tillväxt har bakterierna uppskattats utsöndra tre toxinmolekyler / min / bakteriecell , och subenheter har visat sig ackumuleras i det periplasmiska utrymmet, både som enskilda subenheter och monterade i holotoxiner. Subenhetsackumulering sker genom exponentiell tillväxt även om nivåerna av vissa Ptl-proteiner ökar till mellan 30 och 1000 molekyler per cell. Således kan sekretion snarare än toxinproduktion eller montering vara hastighetsbegränsande. Kärleksfullt, i frånvaro av Ptl–proteinerna, kan vissa subenhetskombinationer, såsom S2-S4-dimeren i närvaro av S1 , utsöndras, även om utsöndringen av holotoxinet starkt beror på närvaron av Ptl-proteinerna.
PTL-proteinerna tros bilda ett komplex som spänner över både inre och yttre membran , och alla (åtminstone PtlA-H) verkar krävas för toxinsekretion, vilket undersöks av mutationer i varje enskild ptl-gen . Några av mutationerna som infördes i trans I vildtyp PTL + – stammar resulterade i en dominerande negativ sekretionsfenotyp, vilket bekräftar att åtminstone PtlC till PtlH är en del av ett multimeriskt komplex. Ett viktigt steg i PTX-sekretion är uppenbarligen dess förmåga att korsa peptidoglykanskiktet, och PtlE har visat sig uttrycka peptidogykanasaktivitet . Detta 276-restlånga protein innehåller likheter med aktiva platser med andra glykohydrolaser, och alaninsubstitutioner på denna plats har visat sig kraftigt minska peptidoglykanasaktiviteten hos rekombinant PtlE. Samma substitutioner i naturlig PtlE avskaffar också utsöndring av PTX av B. pertussis, vilket starkt antyder att PtlE är peptidoglykanas som krävs för att toxinet ska korsa peptidoglykanskiktet.
PTX-sekretion kräver också sannolikt energi. Två av PTL-proteinerna, PtlC och PtlH, innehåller förmodade adenosintrifosfat (ATP)–bindningsställen och kan därmed ge den energi som krävs för toxinsekretion. Båda proteinerna har visat sig vara nödvändiga för utsöndring , och i båda fallen är de förmodade ATP-bindningsställena väsentliga för funktion. För båda observeras en dominerande negativ fenotyp när mutanta alleler samuttrycks med vildtypens allel, vilket tyder på att båda fungerar som multimerer eller ingår i sekretionskomplexet. Ptlh visades vara associerat med det inre membranet, och mutationer i ATP-bindningsstället för PtlH påverkar dess cellulära läge och avskaffar dess interaktioner med andra PTL-proteiner . Den exakta rollen för PtlC är ännu inte känd. PtlD är också ett inre membranprotein och innehåller fem transmembrandomäner. Det krävs för stabiliteten hos PtlE, PtlF och PtlH via dess C-terminal 72-rester. Denna C-terminala region är emellertid inte tillräcklig för toxinsekretion . PtlF visar egenskaper hos yttre membranproteiner (OMPs), men det kan också associeras med det inre membranet. Under icke-reducerande förhållanden migrerar PtlF och PtlI som ett komplex under natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores, vilket indikerar att PtlI binder till PtlF genom disulfidbindningsbildning . Den korrekta disulfidbindningsbildningen mellan PtlI och PtlF kan bero på DsbC, eftersom mutationer i dsbc-genen påverkar utsöndringen utan att påverka toxinaggregatet .
