Clothianidin seed-treatment har ingen detekterbar negativ inverkan på honungsbinkolonier och deras patogener

studiedesign

under 2013, totalt 16 fält (8,9 5,4 ha, genomsnittlig 0,4 ha, s.d.) i södra Sverige, avsedda för vårsådd raps (Brassica napus L.) parades i enlighet med geografisk närhet (men separerade med >4 km) och markanvändning (Fig. 1, Se ovan). Det omgivande landskapet inspekterades för frånvaro av blommande grödor. Under 2013 fanns dock två fält kvar i studien trots att ett annat rapsfält fanns i närheten för att behålla så många gårdspar som möjligt34. I varje gårdspar tilldelades ett fält slumpmässigt att sås med clothianidinbehandlade rapsfrön, medan det andra fältet såddes med frön som inte behandlades med clothianidin (behandlad: 8; kontroll: 8). Samma Parade gårdar användes 2014 men med behandlingarna omvända, dvs platser med behandlade fält 2013 hade kontrollfält 2014 och vice versa (behandlad: 6; kontroll: 4). På grund av växtrotation användes olika fält inom varje gård 2013 och 2014 (Fig. 1, Se ovan). För att skapa Fig. 1, vi hämtade en karta från World Borders Database (nedladdningsbar här: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

Information om omgivande landskapsvariabler för de olika gårdarna 2014 presenteras i Tilläggstabell 7. År 2014 hade hälften av fokalfälten ytterligare vårsådd raps (1-13 ha) inom en radie på 2 km. De clothianidinbehandlade frön för fokalfälten belades med Elado, en varumärkesskyddad blandning av två aktiva ingredienser: clothianidin (400 g l−1) och 60 g l-cyflutrin (+80 g l−1) valdes för denna studie eftersom det var den dominerande insekticidbehandlingen för utsäde i raps i Sverige och i andra delar av Europa63. Clothianidin tas upp av växten och distribueras systemiskt till alla dess delar för skydd mot insekter64. cyflutrin anses inte vara systemiskt och inga rester har påvisats i prover som samlats in i denna studie34. Både clothianidinbehandlade och kontrollfrön belades med fungiciden Tiram 2013.

de deltagande bönderna instruerades att inte använda andra neonicotinoider i fälten under studien, även om andra insektsmedel bladsprayer; främst Plenum (pymetrozin), Avaunt/Steward (indoxacarb) och Mavrik (tau-fluvalinat; används också som varroacid i biodling) användes för skadedjursbekämpning (kompletterande Tabell 8). Biscaya, handelsnamn för en sprayformulering innehållande neonikotinoid tiakloprid, applicerades emellertid på ett kontrollfält 2013, följt av en Mavrik spray 1 vecka senare och till ett behandlat fält 2014, vid båda tillfällena vid 0,3 L ha−1. Tiakloprid har en betydligt lägre akut toxicitet för bin än clothianidin65 och endast spårmängder av tiakloprid upptäcktes i pollen -, nektar-och biproverna 2013 och ingen 2014. Medan Rundl Xhamster et al.34 observerade inte någon förändring i resultaten när fält där Biscaya tillämpades uteslöts från analyserna, vi upptäckte några kvalitativa förändringar (Tilläggstabell 9). Dessa förändringar kan bero på de högre tiaklopridrester som upptäcktes 2014, men kan lika gärna inte relatera till Biscaya utan snarare till skillnaden mellan Biscaya/Mavrik och de alternativa insektsmedel spraykombinationer som används34 eller bero på minskad statistisk effekt.

honungsbikolonier

hundra och sexton honungsbikolonier bereddes i slutet av maj 2013 av en professionell biodlare i enstaka Langstroth-bikupor i full storlek innehållande två kammar med huvudsakligen förseglad kull (med bin), två fulla honungskamrater (med bin), en utdragen Tom kam, fem kammar med vaxfundament, bin skakade från två kammar och antingen en 1-åring (84 experimentella kolonier) eller 2-åring (12 experimentella kolonier plus 20 reservkolonier) drottning av känd härkomst för att producera relativt små, lika stora (3418 123 vuxna bin, medelvärde av sek.; N = 96 kolonier) kolonier med gott om utrymme för tillväxt som kan bli tillräckligt starka för att överleva den kommande vintern, men inte växa ur sitt utrymme under sommaren. Sex experimentella kolonier placerades längs fältkanten i vart och ett av de 16 rapsfälten (totalt 96 kolonier) mellan 14 och 28 juni 2013 vid början av rapsblomningen (kompletterande Fig. 1). Drottning härstamning och ålder matchades mellan gård-par, men kolonierna var annars fördelas slumpmässigt. Kolonier hölls på ett 60 hektar organiskt hanterat vinterolja rapsfält i full blom före placering vid de 16 experimentfälten (kompletterande Fig. 1) för att säkerställa Pre-experiment kolonitillväxt baserades så mycket som möjligt på bekämpningsmedel fritt födosök.

när rapsblomningen i experimentfältet hade upphört flyttades kolonierna mellan 2 och 31 juli (kompletterande Fig. 1) till en gemensam apiary att övervintra. Den 10 augusti fick kolonierna en myrsyraångbehandling mot varroakvalster, bestående av 20 ml 60% myrsyra indränkt i en platt hushållssvamp placerad under det inre locket ovanpå ramarna. Kolonierna matades totalt 20 kg socker per koloni i form av en 55-60% v/v sackaroslösning, tillhandahållen i en utfodringslåda vid tre tillfällen under augusti–September 2013. En ytterligare lätt Varroa-behandling utfördes den 4 December genom att sprinkla 30 ml 2,6% oxalsyra i 60% sackaros mellan ramarna, direkt på biklustret. Våren 2014 flyttades kolonier till ett organiskt hanterat rapsfält innan de placerades på de 10 vårsådda rapsfälten (kompletterande Fig. 1). Kolonier ansågs ingå i 2014-delen av studien om de hade en 2-årig äggläggande drottning i April 2014 (exklusive kolonier som dog, återupptogs eller hade 3-åriga drottningar i April 2014) och hade inte svärmat i början av juni 2014. Dessa begränsningar, förutom kravet på att kolonier skulle exponeras/oexponeras för clothianidin under båda åren av experimentet, innebar att 2014 endast fyra kolonier kunde tilldelas varje fält. Kolonier placerade av behandlade fält 2013 placerades igen av behandlade fält 2014 för att bedöma de kumulativa effekterna av flerårig clothianidinexponering, men randomiserades annars före placering för att minimera oavsiktliga fördomar. Ändå måste två kontrollkolonier från 2013 placeras av ett klotianidinbehandlat fält 2014 på grund av otillräckliga kvalificerade exponerade kolonier för de sex klotianidinbehandlade fälten. Tillräckligt många kolonier fanns tillgängliga för de fyra kontrollfälten. Koloniernas styrka utjämnades enligt beskrivningen för 2013, men endast inom varje behandlingsgrupp. Kolonierna reducerades och utjämnades en andra gång (8 juni 2014), efter att några av dem blev för stora och försökte svärma (kompletterande Fig. 1). Varje reducerad koloni inkluderade 1 Full honungskam (med bin), 3 kammar med huvudsakligen förseglad kull (med bin) och den ursprungliga drottningen från 2013 och 6 kammar med vaxfundament. Kolonier flyttades till vårens rapsfält mellan 16 och 25 juni 2014 och fördes tillbaka till den gemensamma övervintringsplatsen mellan 14 och 22 juli 2014 (kompletterande Fig. 1).

Resthaltsanalyser

för att bekräfta klotianidinexponering analyserades 24 vuxna honungsbin per fält som fångats vid bikupans ingång, pollenpellets som samlats in från 5 honungsbin som fötts i rapsfälten och nektar som avlägsnats från magen på 5 nektarfoder honungsbin i rapsfälten från varje plats för klotianidinrester. Pollen (>25 ml) samlades in med hjälp av pollenfällor, som installerades i 1 dag på tre kolonier per plats och analyserades för växtarters ursprung. Proverna hanterades och analyserades som i Rundl Askorbf et al.34 och samlas in under toppblomningsbedömningarna under båda åren (kompletterande Fig. 1), med koncentrationerna av clothianidin och fyra andra neonicotinoider som används i Sverige (kompletterande Tabell 2) kvantifierade med hjälp av vätskekromatografi i kombination med tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) och pollen identifierade för rapstyp med hjälp av ljusmikroskopi och ett pollenreferensbibliotek (se kompletterande Tabell 2 för detektionsgränser och kvantifiering). För ytterligare analyser av variationen i neonicotinoidexponering av honungsbin på olika platser samlade vi 12 honungsbin per plats från bikupans ingång. Denna provtagning gjordes på tre clothianidinbehandlade platser 2013. Nektar extraherades från honungsmagen hos de uppsamlade bin. Koncentrationerna av clothianidin kvantifierades därefter i både nektar och bivävnad för varje bi individ. Mer information om provbehandling för olika matriser, LC-MS/MS-metod och kvalitetskontroller ges i kompletterande metoder.

koloni utveckling, re-queening och honung produktion

honungsbin koloni utveckling bedömdes av samma utbildade observatör och en assistent. Närvaron av en läggande drottning etablerades, liksom närvaron av drottningsceller. Om en återkommande händelse åtföljdes av en stor förlust av vuxna bin, ansågs det ha svärmat. Om ingen förlust av vuxna bin observerades, kolonin ansågs ha åter queened genom ersättning. Koloni honung produktion och utveckling bestämdes genom att väga kolonierna och genom att bedöma koloni styrka med hjälp av Liebefeld method66, som det totala antalet vuxna bin och området för utjämnade kull över alla ramar. Antalet vuxna bin uppskattades genom att räkna honungsbin på båda sidor av de 10 ramarna. Antalet utjämnade stamceller (mängden stam) bestämdes genom att multiplicera andelen sluten stamtäckning med 2700, vilket är antalet celler på ena sidan av de använda ramarna. Kolonierna vägdes under bedömningar före exponering och efter exponering (med hjälp av en Mettler Toledo-bänkskala som kan väga upp till 32 kg med 1 g precision) för att uppskatta honungsproduktionen. Hela honungsramar ersattes av tomma ramar under rapsblomningen för att låta kolonin växa och minska svärmningen. Både de fulla och de tomma ramarna vägdes för att inkluderas i beräkningen av honungsproduktionen. Vid bedömningen efter exponering avlägsnades så många honungsramar som möjligt (max 10% av området täckt med täckt kull) för att simulera biodlarnas honungsskörd. Preexponeringsbedömningar gjordes på det organiskt hanterade vintersådda rapsfältet den 6-17 juni 2013 och 9-11 juni 2014 och efterexponeringsbedömningar vid den gemensamma övervintringsbigården den 29 juli till 9 augusti 2013 och 28-31 juli 2014 (kompletterande Fig. 1). Dessutom genomfördes en vårkolonistyrkebedömning i April 2014 genom att uppskatta det totala antalet vuxna bin och antalet utjämnade kull (kompletterande Fig. 1). Kolonibedömaren och assistenterna blindades under datainsamling med avseende på fältens behandlingsregim.

insamling och bearbetning av patogen – och parasitprov

prover av cirka 100 vuxna honungsbin togs från varje koloni under bedömningar före och efter exponering i clothianidin-behandlade och kontrollexperimentella rapsfält i både 2013 och 2014 (kompletterande Fig. 1). Bin togs från den yttre kammen i varje koloni och bestod därför av en blandning av husbina och foderbi67. Alla biprover lagrades vid -20 kcal C tills laboratoriearbetet utfördes. V. destructor infestation priser för varje koloni bestämdes genom att tvätta de vuxna biproverna med tvålvatten för att lossa och räkna mites68. Buken på 60 vuxna honungsbin per koloni (för enskilda kolonianalyser) eller per apiary (för 2013-poolade kolonianalyser, 10 bin per koloni) avlägsnades och placerades i en polyetenpåse med ett inre nät (BioReba). Buken maldes i påsen med hjälp av en stöt och 30 ml nukleasfritt (Milli-Q) vatten (0,5 ml per bi) blandades noggrant med provet för att skapa en homogen suspension. Flera 1 ml alikvoter av denna suspension avlägsnades och frystes omedelbart vid -80 kcal C för DNA-och RNA-extraktion och som framtida referensmaterial.

parasiter, patogener, symbiotiska mikrober och immungener

de samlade biproverna bedömdes för en mängd olika patogena och icke-patogena parasiter och mikrober för att studera koloniernas inverkan på klotianidinbehandlade fält på deras prevalens och överflöd. Organismerna inkluderade den allestädes närvarande ektoparasiten Varroa destructor, 13 virus: akut biförlamningsvirus (ABPV), aphid lethal paralysis virus (ALPV), Big Sioux River virus (BSRV), black queen cell virus (BQCV), kronisk biförlamningsvirus (CBPV), deformerad vingvirus typ-A (DWV-A), deformerad vingvirus typ-B (DWV-B), Israeliskt akut förlamningsvirus (IAPV), Kashmir bee virus (KBV), Lake Sinai virus stam 1 (LSV-1) och stam 2 (LSV-2), Sacbrood virus (SBV), slow Bee paralysis virus (sbpv); två vanliga honungsbi Microsporidian gut parasiter (Nosema APIs och Nosema ceranae) och två symbiotiska tarmbakterier (GAMMAPROTEOBACTERIUM: gilliamella APICOLA och betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). För 2013-proverna analyserade vi också på apiarynivå mRNA-nivåerna av åtta honungsbingener (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1a, Eater-liknande, NimC2, PGRP-S2 och SPH51) vars uttryck tidigare hade kopplats till bekämpningsmedel, patogen och/eller parasitexponering19,44 och (social) immunitet i honungsbin45.

Nukleinsyraextraktion

DNA extraherades från bihomogenaten med hjälp av protokollet för att extrahera DNA från Nosema spores69, vilket är tillräckligt robust för att också extrahera DNA från bakterier och andra mikroorganismer. Totalt centrifugerades 500 occl primärt bihomogenat i 5 minuter i en mikrofuge vid 13 000 rpm. Pelleten frystes upprepade gånger-tinades med flytande kväve och maldes med en steril Teflon-mikropestel tills den pulveriserades. Den pulveriserade pelleten resuspenderades i 400 oc Qiagen växtvävnader DNeasy AP1 lysbuffert innehållande 4 oc RNAs-A (10 mg ml−1) och inkuberades och skakades i 10 minuter vid 65 oC, varefter 130 oc P3 neutraliseringsbuffert (3,0 m kaliumacetat pH 5.5) tillsattes, följt av 5 min inkubation på is och centrifugering i 5 min vid 14 000 rpm för att avlägsna lysavfallet. DNA renades från 500 occl av supernatanten av Qiagen automatiserad Qiacube extraktionsrobot, efter anläggningen dneasy protokollet och eluering av DNA i 100 occl nukleasfritt vatten. RNA extraherades av Qiacube-roboten direkt från 100 occyls primära honungsbinhomogenat med Qiagen Plant RNeasy-protokollet (inklusive Qia-shredder för ytterligare homogenisering70) och RNA eluerades till 50 occyls nukleasfritt vatten. Den ungefärliga nukleinsyrakoncentrationen bestämdes av NanoDrop, varefter proverna späddes ut med nukleasfritt vatten till en enhetlig 10 ng Aci ll-1 (DNA och LSV−1(RNA)) eller 20 ng Aci ll-1 (för alla andra RNA−prover) och lagrades vid -80 Aci C.

RT-qPCR och qPCR

de olika mikroorganismerna och värd-mRNA-målen detekterades och kvantifierades genom antingen enstegs omvänd transkription-kvantitativ PCR (rt-qPCR) för patogener med ett RNA-genom och immun-och internreferensgen mRNA-mål, eller genom kvantitativ PCR (qPCR) för organismer med ett DNA-genom. Detaljer om analyserna visas i kompletterande Tabell 10, kompletterande Tabell 11 och kompletterande tabell 12. Den omvända primern för Amel / LRR designades något från Di Prisco et al.19 eftersom den extremt höga komplementariteten mellan de ursprungliga framåt-och bakåtprimrarna resulterade i höga nivåer av PCR-artefakter som dominerade den kvantitativa signalen. Reaktionerna utfördes i två exemplar, i 20 eller 10 (RNA) reaktionsvolymer innehållande 2 (DNA) eller 1,5 (RNA) Mall, 0,4 (DNA) eller 0.2 occurm (RNA) av framåt och bakåt primer och antingen Bio-Rad Eva Green qPCR mix (DNA) eller Bio-Rad One-Step ITAQ RT-qPCR mix med SYBR Green detection chemistry (RNA). Reaktionerna inkuberades i 96-brunns optiska qPCR-plattor i Bio-Rad CFX connect thermocycleren, med användning av följande amplifieringscykelprofiler: 10 min vid 50 kcal C för komplementär DNA (cDNA) syntes (endast RT-qPCR): 5 min vid 95 kcal C (för att inaktivera det omvända transkriptaset och aktivera Taq-polymeraset) följt av 40 cykler om 10 sekunder vid 95 kcal C för denaturering och 30 sekunder vid 58 kcal C för primerglödgning, förlängning och datainsamling. För DNA-analyser användes följande amplifieringscykelprofiler: 2 min vid 98 CB för den initiala denatureringen följt av 40 cykler om 5 s vid 98 CB för denaturering och 10 s vid 60 CB för primerglödgning, förlängning och datainsamling. Amplifieringscyklerna följdes av en smältkurvanalys för att bestämma amplifieringens specificitet genom att läsa fluorescensen vid 0,5 C-steg från 65 C till 95 C. inkluderade på varje reaktionsplatta var positiva och negativa (icke-mall) analyskontroller. För varje typ av analys (Tilläggstabell 10, Tilläggstabell 11 och Tilläggstabell 12) framställdes en kalibreringskurva genom en 10-faldig utspädningsserie med en positiv kontroll av känd koncentration som täckte 6 storleksordningar, för kvantitativ datakonvertering, fastställande av referenssmältningskurvprofilen för amplicon och uppskattning av reaktionsprestandastatistiken.

datakonvertering och normalisering

smältkurvorna för enskilda reaktioner utvärderades visuellt för att separera ut icke-specifika förstärkningar, som skiljer sig i smälttemperaturprofiler från sanna mål-cDNA/DNA-amplikoner. Icke-specifika förstärkningar togs bort från datauppsättningen. Alla analyser kördes i två exemplar, med medelvärdet av dessa två dubbletter som används i ytterligare beräkningar. Båda dubbletterna var tvungna att ge ett positivt kvantitativt värde och passera smältkurvanalysen för att data skulle inkluderas i datauppsättningen. De råa RT-qPCR-data för alla bekräftade förstärkningar konverterades därefter till uppskattade kopianummer för varje mål-RNA, med användning av motsvarande kalibreringskurva för analysen. Dessa data multiplicerades med de olika utspädningsfaktorerna under hela förfarandet för att beräkna de uppskattade kopiorna av varje mål per bee69. Eftersom RNA lätt bryts ned finns det en risk att skillnader mellan enskilda prover i RNA-kvalitet (dvs. nedbrytning) kan påverka resultaten70. För att korrigera för detta kördes RT-qPCR-analyser för mRNA av en vanlig honungsbin intern referensgen (RP49) på alla prover. Data för RNA-målen av intresse normaliserades sedan till medelvärdet för rp49 mRNA, vilket korrigerade data för provspecifika skillnader i RNA-kvalitet med avseende på RT-qPCR-prestanda70.

statistiska analyser

proportionerna av honungsbinuppsamlad pollen som härstammar från växter av raps-typ jämfördes mellan behandlingar (clothianidinfröbehandling/obehandlad) med en generaliserad linjär modell som antar binominalfördelning och korrigerar för överdispersion. Klotianidinkoncentrationerna i nektar och pollen som samlats in av honungsbin och i bivävnad jämfördes mellan behandlingar med Wilcoxon–Mann–Whitney-test. För att jämföra koncentrationerna av clothianidin i bivävnaden och nektar i enskilda bin mellan fält använde vi variansanalyser (ANOVA), med fältidentitet som prediktor. Dessutom var koncentrationerna av klotianidin i vävnaden och nektarmageinnehållet hos enskilda bin relaterade med användning av en multipel linjär regression med fältidentitet och koncentration av klotianidin i nektar som förklarande variabler och koncentration av klotianidin i bivävnad som responsvariabel.

studien följde i allmänhet en före-efter-kontroll-påverkan (BACI) design, med en parad fältstruktur, upprepad i två på varandra följande år på koloni nivå för data om koloniutveckling samt förekomsten och överflöd av parasiter, patogener och tarmbakterier. Åren, 2013 och 2014, analyserades tillsammans i en hel modell, med fröbehandling, blomning, år och deras interaktioner som fasta faktorer. Effekten av clothianidinbehandlingen bedömdes av interaktionen mellan blom-och fröbehandling, eftersom denna term återspeglar skillnaden i förändring mellan behandlingar över rapsblomningen(erna). Om trevägsinteraktionen (bloom-utsädesbehandling av utsäde år) var signifikant (dvs. om variabeln svarade annorlunda på clothianidinbehandlingen från ett år till nästa) delades datasetet med år och år tappades som en fast faktor. Dessutom analyserades datamängden för endast 1 år om uppgifterna bestod av en provstorlek 10 i ett år både för mikrobiotaprevalens och överflöd (kompletterande Tabell 1). Kolonier som svärmade (8 vid kontrollfält och 10 vid klotianidinbehandlade fält 2013; en vid ett kontrollfält och två vid klotianidinbehandlade fält 2014) uteslöts från analysen, eftersom svärmning har stor effekt på koloniutvecklingen. Utesluten är också den enda kolonin som förlorade sin drottning under transport före fältplacering 2013 (behandlat fält). Exklusive kolonier som svärmade från analysen förändrade kvalitativt vissa resultat (se Tilläggstabell 13). Förändringar i signifikansnivå kan bero på minskad statistisk effekt, slumpmässig chans eller biologiska effekter.

linjära modeller med blandade effekter (LMM) användes för att testa effekten av clothianidinbehandlingen på koloniutveckling mätt som antalet utjämnade stamceller (mängden stam) och antalet vuxna bin. Fröbehandling (clothianidin eller kontroll), blomning (före eller efter rapsblomning), år (2013 eller 2014) och deras interaktioner var fasta faktorer. Farm pair identity, farm identity och colony identity inkluderades som slumpmässiga faktorer. Honungsproduktion jämfördes mellan behandlingar med en LMM med gårdsparidentitet och gårdsidentitet som slumpmässiga faktorer. Generaliserade linjära blandade modeller (GLMMs) användes för att testa påverkan av clothianidinbehandlingen på återdrottning och dödlighet hos kolonierna med gårdsidentitet som en slumpmässig faktor.

clothianidinbehandlingens inverkan på vårkoloniutveckling, mätt som antalet vuxna bin och mängden kull, testades med hjälp av en LMM respektive en GLMM med fröbehandling som fast faktor och gårdspar identitet och gårdsidentitet som slumpmässiga faktorer. För antalet utjämnade stamceller använde vi en negativ binomial felfördelning och logaritmisk länkfunktion.

mikrobiom-och varroamittdata analyserades både på deras binomiala (närvaro/frånvaro) och kvantitativa (överflöd) karaktär, med användning av GLMMs (med binomiala felfördelningar och en logit-länkfunktion) respektive LMMs (med normala felfördelningar) med fröbehandling, blomning, år och deras interaktioner som fasta faktorer. GLMMs på mikroorganism eller Varroa mite prevalens inkluderade endast koloniidentitet som slumpmässig faktor, eftersom den effektiva provstorleken (dvs. det mindre frekventa resultatet av närvaro/frånvarodata) inte möjliggjorde inkludering av mer slumpmässiga faktorer. Endast organismer och år med en (effektiv) provstorlek >10 analyserades för både prevalens-och överflödesdata. Dessutom utesluts kolonier som inte åtminstone en gång testade positivt för en viss mikroorganism från analysen av överflöd. Bee-patogen och bakteriell överflöd transformerades logaritmiskt (log10), eftersom de i allmänhet är exponentiellt fördelade. LMMs på målorganismen överflöd innehöll gård par identitet, gård identitet och koloni identitet som slumpmässiga faktorer. Varroa mite-nummer per 100 bin och kolonivikt omvandlades kvadratrot för att undvika icke-normalt distribuerade rester. Konfidensintervall beräknades baserat på profil Sannolikhet. För kvadratrotsomvandlade data omvandlades uppskattningar tillbaka till originalskalan för grafiska illustrationer.

immungenavskrifterna var endast tillgängliga för 2013 och på apiarynivå men följde också BACI-designen. LMMs på genuttryck innehöll fröbehandling och blomning som fasta faktorer och gårdsidentitet som slumpmässiga faktorer.

statistiska dataanalyser utfördes med användning av R förutom analyser som behandlar verifiering av clothianidinexponering och markanvändning, för vilken SAS 9.4 för Windows (SAS Institute Inc.) användes. LMMs passade med lmer-funktionen i lme4-paketet och GLMMs passade med glmmTMB-funktionen i glmmTMB-paketet i R. p-värden från GLMMs beräknades med sannolikhetsprov. P-värden från LMM beräknades med hjälp av Anova-funktionen i bilpaketet, varigenom F-test av typ III användes för modeller som innehöll interaktioner och F-test av typ II för modeller utan interaktioner (dvs. vårbedömning och honungsproduktion). Effekter av fasta faktorer uppskattades med hjälp av summa-till-noll-kontraster i alla modeller utom de på neonikotinoidrester. Summa-till-noll-kontraster möjliggör bestämning av huvudeffekter/interaktioner (dvs. uppskattning oberoende av andra oberoende variabler) och visar effekterna av faktorer som avvikelser från grand mean (intercept). För faktorer med två nivåer är storleken på avvikelsen för varje nivå från det stora medelvärdet detsamma men riktningen skiljer sig åt. Vi representerar effekter av faktorer (fröbehandling, blomning, år), som avvikelsen av den andra nivån (clothianidin, efter, 2014) från grand mean. Detta var också fallet för interaktioner, så att till exempel växelverkan mellan utsädesbehandling av blom i blom indikerar i vilken utsträckning klotianidinutsatta kolonier skilde sig i förändring över rapsblomningen från den genomsnittliga förändringen av båda behandlingarna.

effektanalys

vi utförde effektanalyser för antalet vuxna bin och antalet utjämnade stamceller och honungsproduktion för att undersöka effektstorleken som vi potentiellt kunde upptäcka med tanke på vår design, replikering och modellval. Effekt bestämdes för ett intervall av effektstorlekar vid en nominell konfidensnivå av Xiaomi = 0,05 Med 1000 Monte Carlo-simuleringar per effektstorlek med hjälp av powerSim-funktionen i simr-paketet. Effekten beräknades för en rad effektstorlekar, uttryckt som förändringen i antalet vuxna bin, antalet begränsade stamceller eller honungsproduktion. Genom att dividera effektstorleken med det genomsnittliga antalet bin, det genomsnittliga antalet stamceller eller honungsproduktion av alla kontrollkolonier, fick vi effektstorlek uttryckt som procentuell förändring av dessa matriser (kompletterande Fig. 3). Denna effektanalys gjorde det möjligt att jämföra vår effektstorlek med effektstorleken som presenteras av Rundl Bisexuell et al.34. Med hjälp av den fullständiga modellen kunde vi upptäcka en effektstorlek för antalet vuxna bin under 5% med en effekt på 80% jämfört med effektstorleken under 20% presenterad av Rundl Xhamster et al.34. Detta är ännu lägre än kraven på en effektstorlek < 7% som fastställts av EFSA32. Som ett resultat av en signifikant interaktion mellan fröbehandling, blomning och år analyserades datauppsättningen för antalet utjämnade stamceller separat för varje år. Därför presenterar vi här kraftanalysen för varje år. Effektstorleken vid vilken 80% uppnåddes ökade från under 10% 2013 till något under 11% 2014 (kompletterande Fig. 3), troligen på grund av den minskade replikationen 2014. Vi utförde också en effektanalys av honungsproduktion (mängd honung per koloni i kg) med hjälp av dataset för båda åren, vilket visar att en effektstorlek under 20% kunde detekteras med en effekt på 80% (kompletterande Fig. 3).

rapportsammanfattning

ytterligare information om experimentell design Finns i Nature Research Reporting Summary kopplad till denna artikel.