Colony PCR

Colony PCR är en lämplig metod med hög genomströmning för att bestämma närvaron eller frånvaron av infoga DNA i plasmidkonstruktioner. Individuella transformanter kan antingen lyseras i vatten med ett kort uppvärmningssteg eller tillsättas direkt till PCR-reaktionen och lyseras under det initiala uppvärmningssteget. Detta initiala uppvärmningssteg orsakar frisättning av plasmid-DNA från cellen, så det kan fungera som mall för amplifieringsreaktionen. Primers utformade för att specifikt rikta in sig på Infoga-DNA kan användas för att bestämma om konstruktionen innehåller DNA-fragmentet av intresse. Alternativt kan primers som riktar sig mot vektor-DNA som flankerar insatsen användas för att bestämma huruvida insatsen är rätt molekylstorlek eller inte. Infoga specifika primers kan ge information om både specificiteten och storleken på Infoga DNA medan användningen av vektorspecifika primers möjliggör screening av flera konstruktioner samtidigt. Colony PCR kan också användas för att bestämma insatsorientering. PCR-amplifiering av plasmid med användning av en insatsspecifik primer parad med en vektorspecifik primer kan utformas för att producera en amplikon av en specifik storlek endast om insatsen är i rätt orientering. I alla experimentella mönster bestäms närvaro eller frånvaro av en PCR-amplikon och produktens storlek genom elektrofores tillsammans med en DNA-storleksmarkör på en agarosgel.