detektion och identifiering med PCR av Clostridium chauvoei i kliniska isolat, bovin avföring och substrat från biogasanläggning

prover från misstänkta fall av svartben

för muskelprover från misstänkta fall av svartben, resultaten från odling på FAA-plattor följt av PCR från kolonimaterial var överens med eller utfördes ännu bättre än den biokemiska identifieringsmetoden (tabell 2). Dessa resultat överensstämmer med Uzal et al. . Denna studie visade att DNA-beredning från odling före PCR gav bättre resultat än PCR applicerad direkt på biomassa.

kultur följt av biokemiska identifieringsmetoder är komplicerat i prover med högt innehåll av förorenande flora på grund av behovet av ren odling och känsligheten var väsentligt lägre än för odling och PCR. I åtta fall var det omöjligt att upptäcka C. chauvoei genom kultur och biokemisk identifiering men organismen detekterades med PCR (Tabell 2). För att göra en diagnos av blackleg tas muskelvävnad vid obduktion eftersom mängden C. chauvoei troligen är högre i muskelvävnad än i blod. Det enda blodprovet togs felaktigt, men frågan var svartben.

på samma sätt, i en tidigare studie av ett blackleg-utbrott, gav kultur och detektion med PCR bättre resultat än biokemisk analys . I ett av fallen var primärkulturen av en muskel på en blodagarplatta övervuxen av C. septicum men gav tydliga positiva resultat för C. chauvoei i PCR.

i de flesta kliniska fall av blackleg mängden C. chauvoei i infekterad vävnad är hög och kan lätt detekteras med PCR-metoden oberoende av förorenande flora. Dessutom är PCR-metoden mycket snabbare än den traditionella biokemiska detekteringsmetoden, som tar minst fem dagar, och det är viktigt att ha en ren kultur av stammen, vilket kan kräva extra tid för odling. För att undvika att förorena flora bör muskelvävnaden inte vara för liten; cirka 100-200 g skulle vara tillräcklig. Utan ren odling kan inga stammar vara för efterföljande studier i framtiden, vilket är en nackdel med att använda PCR-detektion som enda metod.

hos nötkreatur experimentellt infekterade med C. chauvoei utfördes PCR-analyser på malet muskel och andra organ och C. chauvoei detekterades i alla testade organ . Hackade muskelstycken från misstänkta fall av blackleg testades direkt med PCR och jämfördes med kultur. Detekteringen med PCR gav bättre resultat än odling och biokemisk identifiering , vilket inte överensstämmer med resultaten i den aktuella studien där endast 12% (3 av 24) av blodet eller muskelbitarna var över detektionströskeln för PCR, medan 9% av köttsaftproverna var över detektionströskeln (Tabell 2). Hämmande ämnen finns förmodligen i muskelvävnader. Hämmare för den enzymatiska reaktionen av PCR-amplifiering har identifierats i lever, mjälte och njure och det kan finnas liknande hämmare närvarande i muskelvävnad. Resultaten från muskelstycken macererade i sterila fysiologiska saltlösningsprover (26%) motsvarade inte bra med de i det biokemiska testet. Direkt PCR på muskelvävnad eller andra liknande prover är förmodligen inte lämplig för att ersätta odlingssteg följt av biokemiska tester eller genom PCR.

Muskelprover som samlats in av swabs

för att undersöka om det är nödvändigt att skicka muskelvävnad för analys av C. chauvoei eller om det är tillräckligt att använda swabs för provsamling, simulerades en posttjänst. Av de 22 undersökta muskelvävnaderna var 64% över detektionsgränsen för PCR. För svabbar från samma prover efter posttjänstsimuleringen var 36% till 47% svabbar över detektionströskeln (tabell 3). Det skulle vara mer praktiskt att ta prov med swabs istället för muskelvävnad om swabs är tillräckliga för analys av C. chauvoei. Muskelvävnader gav emellertid mer positiva prover än swabs när båda analyserades med odling och PCR (tabell 3). Förekomsten av C. chauvoei på swabs från de positiva muskelvävnadsfallen verkade vara slumpmässig. Det verkade dock göra liten eller ingen skillnad om vattpinnarna lagrades i 1, 3 eller 6 dagar.

prover från biogasanläggningar

Clostridium chauvoei detekterades i 3 prover av 11 i biogasubstrat före pastörisering men det kunde inte detekteras efter pastörisering eller efter rötning (Tabell 4). Bakterierna i dessa typer av prover kan komma från gödsel eller från animaliska biprodukter från slakteriet, eftersom båda dessa källor används för biogasproduktion. Ingen av de gårdar som samplades i denna studie skickar sin gödsel till biogasanläggningarna på grund av det geografiska avståndet, men djur skickas till det lokala slakteriet. Fall av svartben har också rapporterats i biogasanläggningens avrinningsområde.

efter biogasbearbetning används de digererade resthalterna som gödningsmedel. Sporbildande bakterier kan överleva pastörisering och matsmältning i biogasanläggningar och digererade rester från biogasanläggningar kan därför kunna sprida svartben till nya områden. Men ingen C. chauvoei upptäcktes i bearbetad produkt så kanske miljön i kokaren inte är lämplig för C. chauvoei, eller floran i kokaren växer ut C. chauvoei. Klostridiala sporer kan överleva under långa perioder i jord , vilket måste beaktas i ytterligare studier på C. chauvoei i kokaren.

prover från gårdar

trots att alla undersökta gårdar hade rapporterat misstänkta fall av svartben de senaste åren testades alla prover från avföring, jord och ensilage negativt för C. chauvoei. Det kan finnas flera förklaringar till detta. Sporer kan fortfarande vara närvarande i materialet, men under detektionsnivån. Dessutom kan PCR-hämmare vara närvarande i proverna och PCR kan hämmas . Nötkreaturavföring innehåller flyktiga fettsyror (VFA) och jordproverna kan innehålla spår av metall, som båda är kända för att störa PCR-reaktionen. Odlingssteget före PCR minskar emellertid påverkan av hämmande ämnen.

Sedan C. chauvoei är en jordbakterie viss säsongsvariation kan förekomma, till exempel kan kraftigt regn bidra till spridning av sporerna och mängden sporer i jorden kan vara mer tillgänglig för nötkreatur. De flesta provtagningar gjordes tidigt på hösten när vädret var soligt och därmed förväntas koncentrationen av sporer i proverna vara låg. Antalet prover kan ha varit otillräckligt för att upptäcka miljöföroreningar. Av praktiska skäl är dock mycket stort antal miljöprover sällan tillgängliga från fältet.

misstänkta fall av svartben på gårdarna hade främst inträffat hos kalvar och kvigor men en gård rapporterade ett fall hos en vuxen ko. Sju av de elva gårdarna A-K hade vaccinationsrutiner på plats vid provtagningstillfället (Tabell 1).

två av gårdarna lagrade gödsel före spridning och de andra gjorde det inte, men ingen av gårdarna sprider gödsel på betesmark. Lokala veterinärer har enligt uppgift sett fler fall av blackleg efter buskröjning på ön Milleniumland, särskilt på Alvaret (en karg kalkstenslätt, nästan 40 km lång och 10 km bred, med speciell flora beroende på tunn jord och högt pH). Alvaret används vanligtvis som betesmark av angränsande gårdar. Inte mycket buskröjning hade gjorts under provtagningsåret.

PCR

Kulturprocedurer är dyra och tidskrävande, och kontaminering med andra anaeroba bakterier som växer ut C. chauvoei orsakar ofta problem . Vid användning av PCR förstärks DNA från både livskraftiga och icke-livskraftiga celler. Om endast livskraftiga celler ska detekteras kan ett anrikningssteg tillämpas . I denna studie användes kultur på FAA-plattor före PCR för att undvika detektion av icke-livskraftiga bakterier och falska positiva PCR-reaktioner. DNA är lätt att förstärka från rena kulturer, men problem uppstår med förorenade prover, såsom prover från bioavfall. Detektion av DNA genom PCR kan hämmas av många ämnen inklusive humussyror, VFA, fetter och proteiner . Odlingssteget före PCR användes emellertid som ett anrikningssteg och minskar därför påverkan av hämmande ämnen. På grund av den svärmande floran kunde ingen rening från FAA-plattorna göras.

detektionströskel för PCR-metoden

detektionsnivån var 200 cfu/g. detta kan tyckas vara en dålig detektionsnivå men det kan förklaras av det faktum att prover som gödsel, jord och biogasunderlag är kraftigt förorenade av den omgivande floran. Sasaki rapporterade en detektionsnivå på 10 cfu/g, tydligen i renare prover. Eftersom detektionsnivån i vår studie var 200 cfu / g och eftersom sådana prover förväntades innehålla ett lågt antal C. chauvoei. Således är metoden som används i den aktuella studien inte praktiskt tillämplig.

miljöaspekter

detektionströskeln för PCR – metoden efter förodling är knappast i nuvarande skede lämplig för att garantera att djur är fria från infektion eller för att bestämma betesmarkens status. Istället måste de för närvarande tillämpade rekommendationerna användas, eftersom metoden inte kan användas som grund för vaccinationsrutiner. I områden där svartben är endemisk rekommenderas årlig vaccination före bete, trots kostnader och tid som krävs.

denna studie gav en viss indikation på att C. chauvoei inte passerar genom biogasprocessen. Antalet C. chauvoei i bioavfall minskade kanske i kokaren till under detektionsgränsen för metoden och risken för spridning av digererade rester är således försumbar. Fler studier om clostridial överlevnad genom biogasprocessen behövs innan konkreta slutsatser kan dras. Men fördelarna med digererade rester som gödningsmedel uppväger kanske risken för spridning av svartben.