diagnostisera inflammation och infektion i urinvägarna via proteomics

Provkällor för att utvärdera urinproteomdata för urindiagnostiska ändamål

samlingen av 120 urinprover som profilerades i denna studie var inte begränsad till diagnos, bedömning av progression eller behandling av en specifik sjukdom. Urinalys (UA) av proverna beställdes av behandlande läkare av olika skäl inklusive akut skada, vaginal blödning, yrsel/illamående, hyperlipidemi, typ II-diabetes och tillhörande komplikationer, buksmärta/illamående, ospecificerad hypertoni, blåshypertension, idiopatisk polyuri och misstänkt UTI. Eftersom UTI är en mycket vanlig infektionssjukdom kopplad till några av de ovan nämnda kliniska symtomen (t.ex. buksmärta/illamående) och riskfaktorer (t. ex. diabetes), förväntade vi oss frekvent diagnos av bakteriuri eller UTI från dessa prover. Proteomiska analyser var begränsade till prover där urinanalysrapporter gav preliminärt stöd för bakteriellt orsakade uti (se metoder). Vi analyserade inte urinprover i fall där den specifika diagnosen asymptomatisk bakteriuri gjordes tillgänglig. Omfattande ua-data erhölls för alla 120-proverna. Detta inkluderade mätsticktester, mikroskopisk undersökning av urinsediment för olika celltyper och slem och – i 46% av fallen – urinodlingsdata (UC). Data om urinutseende såsom grumlighet, färg och urinpelletsfärg och volym granskades också. Urinalysresultat möjliggjorde en omfattande jämförelse av de konventionella metoderna för att diagnostisera sjukdomar i urinvägarna med data från metaproteomiska undersökningar (ytterligare fil 3: Tabell A3).

neutrofiler, de dominerande effekterna av medfödda immunsvar i urinvägarna, står för höga inflammationsnivåer i många prover

Proteomiska data gav starka bevis för neutrofilernas viktiga roll som effektorer och budbärare av inflammation i urinvägarna. Neutrofiler frigör antimikrobiella och inflammatoriska molekyler från sekretoriska granuler de producerar och dödar invaderande patogener i fagolysosomer efter deras fagocytos. En hierarkisk klusteranalys optimerad för PROVBLADSORDNING (HCLSO) identifierade fyra provkluster med humana proteinöverflödesprofiler dominerade av neutrofiler (23 av 111 fall; NAD1-kluster i Figur 1) och två kluster med neutrofilspecifika proteinmängder jämförbara med de som är associerade med cytoskelettet (25 fall; NAD2-kluster i Figur 1). Cytoskeletala proteiner uttrycks starkt i epitelceller som fodrar det urogenitala området och utgör majoriteten av urinsedimentproteomen i frånvaro av patofysiologiska tillstånd i urinvägarna. Trettiofem av de 48 nad-klusterprofilerna var positiva för IDs av en uropathogen inklusive G. vaginalis, vilket indikerar det faktum att en dominerande orsak till inflammation hos respektive patienter var bakteriuri och ett immunsvar mot de invaderande mikroberna. Orsaken till avstånden mellan NAD-klustren i länkträdet var den avsevärda variationen i antalet identifierade humana proteiner från 200 till 1 500 ID per prov.

hierarkisk klusteranalys av urinpelletsproteomiska profiler för 110 prover. Hierarkisk clustering utfördes på kvantitativa humana proteindataset med användning av TPA-metoden i MaxQuant-programvaran. Datamängderna utsattes för Pearson korrelationsanalys med provbladsorderoptimering och fullständig länkklustring med hjälp av mjukvaruverktyget MeV . Vi eliminerade proteinöverflödesvärmekartan från det visade hierarkiska trädet i UP-proverna. Den nedre delen av panelen på vänster sida ansluter till toppen av panelen på höger sida när det gäller träd kopplingar. Exempelklusternamnen, som visas längst till höger om grafiken med deras akronymer, diskuteras i detalj i texten. Färgade staplar anger typ, storlek och position för varje provkluster i trädet.

neutrofila proteinöverskott härledda från proteomiska data korrelerar väl med LE-aktiviteter och leukocytantal

en nyckelmotivation för denna studie var att bestämma hur proteomiska data härledda från urinsediment jämfört med konventionella analyser för att kvantifiera nivåer av inflammation i urinprover. Vi bestämde kvantiteterna av 35 proteiner som är kända för att vara starkt uttryckta i aktiverade neutrofiler (ytterligare Fil 2: Tabell A2) i förhållande till total proteinöverflöd för varje UP-prov, som visas i blå stapelsegment av diagrammet som visas i Figur 2. Inte oväntat var 85% procent av fallen som tillhör ovannämnda NAD1-kluster i sektionen av grafen med större än 30% neutrofilproteininnehåll (på vänster sida). De 35 proteinerna inkluderade fem funktionella grupper: de kalciumbindande S100-familjeproteinerna S100-A8, S100-A9 och S100-A12 som bidrar med 40-50% av det totala cytosoliska proteininnehållet i neutrofiler; proteiner som frigörs under inflammation från neutrofila granuler, inklusive myeloperoxidas (MPO), cathepsin G (CTSG), defensin-1 (DEFA1), elastas (Elane), lysosom (LYZ), laktotransferrin (LTF) och katelicidin (CAMP) ; proteiner som är inblandade i bildning, handel och fusion av granuler med fagolysosomer, inklusive grancalcin (GCA), plastin-2 (LCP1), annexin A3 (ANXA3), och tetraspanin (cd63-antigen); proteiner som påverkar neutrofil migration i miljön av en OMORGANISERANDE extracellulär matris, såsom integrin am/XXL 2, gelatinas (mmp9) och neutrofil kollagenas (mmp8); och NADPH-oxidas, ett enzym med flera subenheter inklusive cytokrom b-245 (CYBA, Figur 3) som ligger i membranet av fagolysosomer av fagocytiska celler och ansvarar för oxidativ burst som direkt dödar patogener. Många av dessa proteiner, särskilt defensin-1, var mycket rikliga i prover med bevis på UTI (t.ex. SA_112 och PM_20, Figur 3). Bakteriepatogenerna i de två fallen var S. aureus (SA) och P. mirabilis (PM) och var inte oväntat belägna på vänster sida i diagrammet i Figur 2 och intill varandra i ett NAD1-kluster (Figur 1). Vi erkänner att dessa data återspeglar ungefärliga mängder neutrofiler med tanke på att proteiner som defensin-1, LTF, S100-A8 och S100-A9 också släpps ut i urinvägarna av urotelceller. Hierarkisk klusteranalys optimerad för proteinbladordning (HCLPO) visade emellertid att dessa proteiner grupperade med varandra och stödde uppfattningen om en dominerande roll av neutrofiler i deras produktion (ytterligare fil 4: Figur A1). Eosinofilperoxidas (EPX) och eosinofilkatjoniskt protein (ECP) som båda också är effektorer av svaret mot patogener var en storleksordning mindre riklig än neutrofil-härledda proteiner, vilket inte stöder en viktig roll av eosinofiler i det inflammatoriska svaret. Den makrofagspecifika migrationshämmande faktorn (MIF) var närvarande i ännu lägre kvantiteter, vilket tyder på nästan frånvaro av makrofager som deltagare i akuta immunsvar efter patogeninvasion i urinvägarna.

Proteinprofiler som visar kvantitativa bidrag från neutrofiler, komplementsystemet och erytrocyter till det totala proteomet i urinpelletsprover. Grafen visar de summerade proteinöverflödena, i förhållande till det totala proteomet, för tre biologiska proteinkategorier. X-axeln listar identifierarna för UP-proverna associerade med 110 människor. De tre kategorierna representerar proteiner som produceras av aktiverade neutrofiler (blå), proteiner som uttrycks starkt i erytrocyter och frigörs vid vaskulär skada (grön) och proteiner associerade med komplementsystemaktivitet och koagulering (röd). Metoden som används för kvantifiering av alla proteiner är iBAQ-metoden i MaxQuant software tool. Ordningen av prover är baserad på neutrofil protein överflöd, minskar från vänster till höger. För att möjliggöra direkta jämförelser för bedömning av inflammation inkluderades poängen för Le-analysen i grafiken ovanför varje stapel som representerar ett prov. Under X-axeln visar en ytterligare stapel vilka prover som var associerade med ID för en patogen som orsakade UTI (ORANGE färgsegment), kommensala bakterier (gröna färgsegment) eller brist på bakteriella ID (ingen färg).

överflöd av utvalda neutrofila proteiner i UP-prover. Tretton proteiner som anges i legenden längst till höger är neutrofila granulproteiner. Tre andra proteiner är fibrinogen-Xiaomi (FGB; inblandad i koagulation), hemoglobin-subenhet (hba1; och uromodulin (UMOD; rikligt i urinen hos friska givare). Proverna SA_112 och PM_20 representerade uti orsakade av S. aureus (SA) respektive P. mirabilis (PM). Profilen för LG_23 (Lactobacillus) indikerade bristen på inflammation och representerade urinrörskolonisering, eventuellt också mindre vaginal kontaminering av urinprovet. KP_10 (K. pneumoniae) verkade representera vaginal infektion eftersom vaginal blödning diagnostiserades kliniskt för patienten. Proteinprofilerna för EC_13 (UPEC) och KP_55 föreslog nästan frånvaro av inflammation, och därför troligen urinrörskolonisering. Proteiner kvantifierades med iBAQ-metoden, i varje fall dividerat med de summerade iBAQ-värdena för hela UP-proteomen.

nad-poäng

representationen av neutrofila proteinmängder i diagrammet i Figur 2 härrör från nad-poängen (neutrofil aktivering och degranulering) som också anges i (ytterligare fil 3: Tabell A3). Figur 2 inkluderar Le-poäng som sträcker sig från negativ (N) till spår (T), 1, 2 och 3 för varje prov. Sammantaget observeras en stark korrelation av neutrofilproteinöverskott och LE-poäng. Le-poängen mäter leukocytesterasaktivitet, som sannolikt representerar främst elastas (ELANE) och myeloblastin (PRTN3), två neutrofila proteaser kvantifierade för åtta prover i Figur 3. Alla profiler på vänster sida av diagrammet (Figur 2) och femtiotre av de 60 proverna med mer än 30% (iBAQ) neutrofilproteininnehåll hade LE-poäng på 2 eller 3. Tjugonio av de 40 proverna med mindre än 23% (iBAQ) neutrofilproteininnehåll hade LE-poäng från negativa till 1. I endast fyra av elva fall där Le-poängen var 2, men neutrofilproteininnehållet var relativt lågt, var det mikroskopiska leukocytantalet större än 11 celler per högeffektfält (HPF), ett tröskelvärde som används för att definiera pyuri. Sammantaget var det något mindre överenskommelse i jämförelsen av leukocytantal som fastställde tröskeln vid 11 celler / HPF med mer än 30% (iBAQ) neutrofilproteininnehåll: 14 av de 60 fallen hade räkningar 10 10 (ytterligare fil 3: Tabell A3). Sammanfattningsvis verkar bedömningen av neutrofilinnehåll i urinsediment via proteomik vara minst lika exakt som Le-analysen för att diagnostisera inflammation i urinvägarna. Det mäter summan av överflöd av 35 proteiner berikade i neutrofiler och kan vara mindre mottagliga för falska positiva resultat jämfört med Le-analysen.

överflöd av erytrocytproteininnehåll fungerar som diagnostisk indikator på vaskulär skada

vaskulär skada i urinvägarna, typiskt associerad med inflammation, bedöms med mätsticktest för hemoglobin och mikroskopisk räkning av röda blodkroppar vid konventionell urinanalys. Med tanke på den höga anrikningen av distinkta proteiner i erytrocyter kunde vi utveckla ett proteomiskt tillvägagångssätt som motsvarar konventionella tester för hematuri. Summerade överflöd av 32 röda blodkroppsproteiner, inklusive hemoglobinunderenheter, band 3 anjontransportprotein, band 7 integrerat membranprotein och kolsyraanhydras-1, i förhållande till total proteinhalt i varje UP-prov bestämdes, visas av de gröna stapelsegmenten i diagrammet som visas i Figur 2. Dessa proteinmängder listas som ERY-poäng i (ytterligare fil 3: Tabell A3) för varje prov. Det fanns inga bevis för en god korrelation av antingen nad-poäng eller LE-analysresultat med ERY-poäng, vilket tyder på att även i fall av detektering av en patogen (visad genom färgning av den horisontella stången längst ner på tomten i Figur 2), neutrofil infiltration av urinvägarna medför inte alltid signifikant hematuri och vävnadsskada. Genom att ställa in tröskelvärdena för hematuri vid 2+ för mätsticktestet och 4, 5% för ERY-poängen var det enighet bland 81% av alla fall. För de 21 fall där poängen inte var överens bedömdes mikroskopiska röda blodkroppar. Med hjälp av ett antal större än 10 celler per högeffektfält (HPF) som bevis på hematuri fann vi att i två tredjedelar av fallen var den mikroskopiska analysen i överensstämmelse med proteomiska data. Vi drar slutsatsen att proteomic ERY-poängen ger en bra kvantitativ uppskattning av hematuri i urinen.

urinprover berikade i proteiner involverade i komplementaktiviteter och koagulering

vi observerade att HCLPO-analysen applicerades på alla urinproteomiska profiler grupperade 21 proteiner med funktionella roller i koagulationsvägar och/eller komplementsystemet (ytterligare fil 4: Figur A1). Motiveringen för att mäta proteinöverskott som hänför sig till dessa inflammatoriska vägar gemensamt baserades också på rapporter om omfattande funktionella interaktioner . Vi identifierade 42 proteiner associerade med komplementsystemaktiviteter och koagulation (CAC) vars summerade överflöd ingår som CAC-poäng för varje UP-prov i (ytterligare fil 3: Tabell A3). Komplementsystemet bidrar till akutfasrespons och medfödd immunitet, och distinkta komponenter är pro – eller antiinflammatoriska. En central komponent är komplementkomponent C3. C3 mognar till opsonin C3b och anafylatoxin C3a och utsöndras i blodplasma och urinvägarna efter produktion i renala tubulära celler . C3 spelar en roll i övre urinvägsinfektion och upptag i och quiescence av UPEC i uroepiteliala celler eventuellt associerade med det kliniska problemet med återkommande UTI . Även om mängderna proteiner kopplade till komplementaktiviteter och koagulering inte var lika höga neutrofila proteiner, genererade HCLSO-analysen två provkluster, intill i trädet och med ett totalt antal 12 prover, kännetecknade av relativt hög överflöd av sådana proteiner (CAC-klustren i Figur 1). CAC-kluster avslöjade ett lågt antal fall med ett ID för en patogen (3 av 12). CAC-poäng plottades i Figur 2 avbildad av de röda stapelsegmenten i varje prov (kolumn). Höga totala mängder CAC-proteiner korrelerade inte bra med höga mängder neutrofila proteiner vilket tyder på att inflammatoriska aktiviteter medierade av komplementsystemet (t.ex. C3 och C4) och koagulering (t. ex. fibrinogen) kan regleras separat vid patogeninvasion eller andra påfrestningar urinvägarna utsattes för hos patienter. Höga CAC-och ery-proteinmängder observerades oftare i tandem. Många koagulations-och komplementproteiner är verkligen rikliga i blodplasma. Denna kroppsvätska läcker in i urinvägslumen vid vaskulär skada. Urinalysprov som motsvarar mätningen av CAC-poäng används sällan i kliniska laboratorier.

utfällning av urinsyrasalter och tillhörande urinsedimentproteomiska profiler

visuell inspektion av 12 UP-proverna i CAC-kluster avslöjade att nio urinprover var mycket grumliga och tio urinpellets relativt stora med en rosa till ljusbrun färg. Dessa funktioner har kopplats till höga mättnadsnivåer av urinsyra och utfällning av urinsyrasalter, särskilt vid ett pH under 6, i urinen. Utfällning av urinsyra kan vara ett prekursortillstånd för urinstenbildning . Det är rimligt att anta att provernas molniga utseende bidrog till att felaktigt identifiera fällningarna som bakterier under mikroskopi. Endast en klinisk post var tillgänglig som rapporterade förekomsten av njursten (GV_64). Även om den proteomiska profilen för denna patient inte var en del av CAC-klustret, uppgav de visuella egenskaperna hos provet också grumlighet och en rosa-till ljusbrun urinpelletsfärg. Vi antar att proteiner relativt rikliga i den lösliga fraktionen av urin binder till saltfällningarna och därför bidrar till distinkta proteinöverflödsmönster i respektive UP-prover. Faktum är att proteiner i allmänhet lösliga i urin och normalt med låg överflöd i urinpellets ökades i överflöd i vissa CAC-klusterprover i förhållande till en kontroll utan bevis på UTI och saltfällningar (LG_21). Exempel på sådana proteiner är IgG-kedjan, AMBP (bikunin) och fibrinogen-kedjan, såsom visas i Figur 4. Proteinerna defensin – 1 och subenheterna HBA1 och HBD för hemoglobin ökade starkast i överflöd jämfört med data för LG_21. Även om de flesta proteiner som visas i Figur 4 är kända för att öka i urin och plasma som en följd av lokal skada och bidrar till den akuta fasresponsen, visade dessa data hög kvantitativ variation. Patologisk betydelse, särskilt skada i urinvägarna, kan inte härledas från dessa data. Proteomiska profiler rapporterades nyligen för urinstenmatrisen . Bland de mest observerade proteinerna i stenmatrisen var IGG-tunga kedjor, fibrinogen-subenheter, S100-A8, lysozym C och LTF, proteiner som också visas i diagrammet i Figur 4. Ytterligare undersökningar behövs för att utvärdera värdet av proteomisk analys för att identifiera biomarkörer från urinprover som innehåller urinsalt fälls ut, t.ex. för att bedöma risken för njurstenbildning.

överflöd av utvalda proteiner i prover med bevis på saltutfällning i urinen. UP-prover som började med nm_ (inga mikrober) visade inte bevis på bakteriekolonisering, men urinsedimenten hade ett visuellt utseende som tyder på att urinsyrasaltet fälls ut och var närvarande i två CAC-kluster. LG_21 (Lactobacillus) representerade frånvaron av inflammation. Patienten associerad med prov GV_64 (G. vaginalis) diagnostiserades med njursten. Förutom de proteiner som beskrivs i legenden om Figur 3 är andra komplementkomponenten C3 (C3), ceruloplasmin (CP), plasminogenaktivatorinhibitor-3 (PAI-3), AMBP (bikunin), hemoglobinabi-subenhet (HBD) och immunoglobulin-kedja (ig gamma). Alla dessa proteiner är inblandade i det akuta fasresponsen, som vanligtvis initieras av vävnadsskada och patogeninvasion. Provprofilerna visar hög variation av proteinmängder, även om distinkta akuta fasproteiner ökades jämfört med kontrollen LG_21 i några av proverna.

uretral kolonisering av kommensala bakterier som inte framkallar värdimmunsvar

mycket parallella DNA-sekvenseringstekniker har avslöjat att urin inte är helt steril, och begreppet urinmikrobiom har utvecklats som ett intressant forskningsämne . Det är troligt att yttre delar av urinröret, särskilt hos kvinnor, koloniseras med bakterier från perineala och vaginala källor. Det är också uppenbart att suboptimal insamling av renfångad urin från kvinnliga patienter kan leda till kontaminering av urin med proteiner och kommensala bakterier från vaginalhålan. Data som presenteras här kan förklaras av, men skiljer inte de två ovannämnda scenarierna. Cirka 25% av urinproteomprofilerna som erhölls i denna studie berikades för proteiner som utsöndrades i urin i en fysiologiskt normal miljö (t.ex. uromodulin och cytokeratiner) eller producerades rikligt av epitelceller som skjulades av slemhinneytor som fodrar urin-och vaginala kanaler. HCLSO-analysen identifierade fyra kluster (Figur 1), ett stort kluster med 15 UP-prover, härledda från kvinnliga patienter med endast två undantag. Profilerna avslöjade ett stort överflöd av cytoskeletala proteiner (t.ex., actiner och annexiner), desmosomala proteiner (t. ex., desmoplakin och periplakin), och cornified cellhölje proteiner (t. ex., cytokeratiner, cornulin, och små prolin-rika protein 3). Proteiner som tillhör de två första kategorierna är närvarande i de flesta celltyper inklusive uroteliala celler , medan stratifierat skivepitel beläget i urinrörets meatus och vaginalkanalen producerar proteiner från alla dessa kategorier rikligt . Mikroskopisk undersökning av urinsediment bekräftade det ökade innehållet i skivepitelceller med poäng 2 + för de flesta prover som finns i de fyra klustren (ytterligare fil 3: Tabell A3), kallad uromodulin och skivepitelcellskluster med vaginala bakterier (USEV) härifrån. Uromodulin, ett protein som bidrar till vatten/elektrolytbalansen i urinvägarna , var också rikligt i proverna från USEV-klustret. Vaginala bakterier (Lactobacillus och G. vaginalis) identifierades från 22 av 30 prover, och bakterier var frånvarande i 5 av dessa prover. Proteomiska data bekräftade en mycket låg nivå av inflammation för USEV-kluster i 74% av fallen enligt NAD-poäng som framgår av positionerna för proverna i grafiken i Figur 2. En representativ profil för usev-klustret är LG-23, Med en nad-poäng på 20% och låga överflöd av inflammationsassocierade proteiner förutom defensin-1 och S100A8 (Figur 3). Jämfört med profilerna för SA_112 och PM_20 var alla proteiner som bidrog till inflammation mindre rikliga i LG_23. G. vaginalis kan vara en opportunistisk patogen i urin-och vaginalvägarna. Kluster av värdproteinprofilerna i usev-klusterna, utvalda för IDS av Lactobacillus, G. vaginalis eller båda arterna, indikerade bristen på ett starkt immunsvar mot dessa bakteriearter. Vi drar slutsatsen att den proteomiska analysen har diagnostiskt värde genom att ge bevis på frånvaron av en infektion i kvinnans urogenitala kanal.

uretral kolonisering av opportunistiska patogener

usev-klusterna inkluderade tre fall där vanliga urinvägspatogener identifierades, UPEC och K. pneumoniae. De två fallen (EC_13 och KP_55) visade låga nad-och ERY-poäng, vilket var i överensstämmelse med frånvaron av neutrofilutlöst inflammation och vaskulär skada. Relativa överflöd av proteinerna som visas i Figur 3 för dessa två fall och deras likhet med mönstret observerat för LG_23 stödde uppfattningen att immunsvar som är karakteristiska för UTI inte framkallades vid kolonisering av bakterierna. Huruvida Fallen representerar asymptomatisk bakteriuri (ASB) kan inte bedömas på grund av brist på kunskap om immunsvar på molekylär nivå för ASB. Sammanfattningsvis stöder dessa data uppfattningen att proteomiska profiler kan identifiera fall av urinrörskolonisering av uropatogener utan aktivering av det medfödda immunsystemet.

Vaginal kontaminering med bevis på urogenitala infektioner

HCLSO-analysen genererade ett UP-provkluster som vi kallade vaginal kontaminering (VCO) kluster, som visas i Figur 1. VCO-klusterprofilerna innehöll höga överflöd av cytoskeletala, desmosomala och kornade cellhöljeproteiner, men låga eller måttliga uromodulin kvantiteter, vilket tyder på att vaginalt proteininnehåll ökades i dessa prover. VCO-poängen, ett kvantitativt förhållande av fem proteiner uttryckta i cervicovaginal epitelvävnad med relativt hög specificitet enligt databasen TiGER jämfört med uromodulin beräknades. Dessa proteiner var cornifelin, cornulin, serpin B3, galektin-7 och proteoglykanmucin-5B. Neutrofilspecifika proinflammatoriska molekyler, såsom proteinet S100-A12 och lysozym (LYZ) och proteiner som indikerar eller svarar på vaskulär skada (HBA1 respektive fibrinogen-bronkier) var mer rikliga i VCO-klustret jämfört med USEv-klustret, vilket visas för KP_10 jämfört med LG_23 i Figur 3. VCO-klustret innehöll 14 prover, alla utom en härledda från kvinnliga patienter, varav hälften var associerade med ett ID för en uropathogen. I fem prover identifierades G. vaginalis eller Lactobacillus. Kliniska bevis föreslog vaginal blödning för patienten avseende prov KP_10, som stöder diagnosen urogenital eller vaginal infektion med K. pneumoniae. VCO-poängen ingår i ytterligare fil 3: Tabell A3. Ett Wilcoxon rank sum-test som jämför VCO-poängen för VCO-och USEV-klustren gav ett p-värde på 0,017, vilket tyder på att poängen är användbar för att urskilja ingen eller mindre från större vaginal kontaminering i urinprover. Inga tydliga bedömningar kan göras angående VCO-poängens användbarhet för att skilja en UTI från vaginal infektion.

Proteomisk analys av urinsediment identifierar mikrober med känslighet och specificitetsnivåer jämförbara med urinkulturen

vi identifierade bakterier från 76 UP-prover och Candida albicans från ett UP-prov (63% av alla analyserade fall). Urinkulturer utfördes i endast 55 fall, varav 44% identifierade minst en patogen, 24% kommensala organismer och 17% visade ingen mikrobiell tillväxt (ytterligare fil 3: Tabell A3). I samband med patogenidentifieringar var proteomiska data och UC-resultat inte alltid överens (Tabell 1). Flera orsaker verkar bidra till oenigheterna. Utmaningarna att tolka metaproteomiska data baserat på de identifierade mikrobiella proteinerna följer. För det första kan protein-ID för mindre vanliga uropatogener missas på grund av frånvaron av deras proteinsekvenser från den sökta databasen. Bakteriearter representerade i databasen identifierades via proteomisk analys (K. pneumoniae och E. faecalis) i två fall, men UC-data föreslog närvaron av de fylogenetiskt nära arterna Enterobacter aerogenes respektive E. faecium. För det andra är mikrobiella organismer som finns i lågt överflöd i urinen svårare att identifiera i närvaro av mycket rikliga mikrober, särskilt om de mikrobiella arterna delar omfattande sekvensidentitet bland orthologa proteiner. EC_85-och KP_11-profilerna i (tilläggsfil 5: Dataset A1) illustrerar detta problem och gäller särskilt familjen Enterobacteriaceae som orsakar majoriteten av alla uti. Felaktiga genomiska anteckningar, t. ex. saknade gener, för en art (närvarande i UP-provet) resulterar i identifiering av orthologa proteiner som är korrekt annoterade i genomet hos en besläktad art (men frånvarande i UP-provet). Små tryptiska peptider identifieras i en hagelgevärsproteomisk analys, vilket gör felaktiga proteintilldelningar av sökalgoritmen mer troliga i fall av hög sekvensidentitet. För det tredje kan ID för bakterier som finns i låga antal i urin, mindre än ~ 10 000 celler/mL, kombinerat med en proteomisk bakgrund med hög värd, missas eftersom värd-och mikrobiella proteiner inte undersöks separat av LC-MS/MS.låga CFU-räkningar för bakterieorganismer enligt UC-data visade en lägre matchningshastighet med proteomiska id: er än höga CFU-räkningar (ytterligare fil 3: Tabell A3). Däremot har proteomiska identifieringar av mikrober fördelarna att de är kulturoberoende och att de ger information om virulens, antibiotikaresistens, stött på stress och tillväxttillstånd för de identifierade patogenerna. Två exempel som avslöjar sådana omfattande data finns i (tilläggsfil 5: Dataset A1). I en dataset (EC_85) profilerades proteiner av UPEC, G. vaginalis och Lactobacillus. I den andra datauppsättningen (KP_11) var orsaken till UTI K. pneumoniae. Tabell 1 ger en översikt över jämförelsen av nitrittestet, som identifierar Enterobacteriaceae i urin baserat på deras förmåga att minska nitrater och UC-resultat med proteomiska data. 90% av de positiva nitrittesterna gällde faktiskt fall av bakteriuri med UPEC eller K. pneumoniae som orsaksmedel och identifierades alltid med proteomiska och UC-metoder också. Till skillnad från den proteomiska analysen verkade nitrittester inte vara tillräckligt känsliga för att identifiera Enterobacteriaceae i tio fall. Nitrittester var inte positiva i 21 fall där ID från proteomiska analyser var G. vaginalis. När det gäller skillnader i patogen-IDs via proteomiska kontra UC-metoder identifierades ovarie-hemolytiska streptokocker genom UC-experiment i tre fall medan proteomiska data föreslog närvaro av G. vaginalis. Som visas i Tabell 1 var antalet matchande ID för UPEC och, i mindre utsträckning K. pneumoniae, höga. Sammanfattningsvis visade den proteomiska metoden högre känslighet än nitrittestet och känslighets-och specificitetsnivåer jämförbara med UC. Proteomisk bakgrund med hög värd i ett urinprov minskar känsligheten för mikrobiell identifiering.