få klarhet: Hydrogelprocess skapar transparent hjärna
KLARHETSPROCESS: intervju med Stanford bioengineer och psykiater Karl Deisseroth. Längd: 3:58
“att studera intakta system med denna typ av molekylär upplösning och global omfattning – för att kunna se den fina detaljerna och den stora bilden samtidigt — har varit ett stort otillfredsställt mål i biologi och ett mål som klarhet börjar ta itu med”, sa Deisseroth.
“denna prestation av kemiteknik lovar att förändra hur vi studerar hjärnans anatomi och hur sjukdomen förändrar den”, säger Thomas Insel, MD, chef för National Institute of Mental Health. “Den djupgående studien av vårt viktigaste tredimensionella organ kommer inte längre att begränsas av tvådimensionella metoder.”
intakt vuxen mush hjärna före och efter den två dagar långa KLARHETSPROCESSEN. I bilden till höger kan de fina hjärnstrukturerna ses svagt som områdena suddighet över orden” nummer”,” outforskad”,” kontinent “och” sträckor.”
forskningen i denna studie utfördes främst på en mushjärna, men forskarna har använt klarhet på zebrafisk och på bevarade mänskliga hjärnprover med liknande resultat, vilket skapar en väg för framtida studier av mänskliga prover och andra organismer.
“klarhet lovar att revolutionera vår förståelse för hur lokala och globala förändringar i hjärnstruktur och aktivitet översätter till beteende”, säger Paul Frankland, PhD, en senior forskare inom neurovetenskap och mental hälsa vid Hospital for Sick Children Research Institute i Toronto, som inte var inblandad i forskningen. Franklands kollega, seniorforskare Sheena Josselyn, PhD, tillade att processen kunde göra hjärnan från “en mystisk svart låda” till något väsentligen transparent.
en outgrundlig plats
högen av invecklad grå substans och ledningar som är hjärnan är en komplex och outgrundlig plats. Neuroscientists har kämpat för att fullt ut förstå sina kretsar i deras strävan att förstå hur hjärnan fungerar, och varför, ibland, det gör det inte.
Karl Deisseroth
CLARITY är resultatet av en forskningsinsats i Deisseroths laboratorium för att extrahera de ogenomskinliga elementen — i synnerhet lipiderna — från en hjärna och ändå hålla de viktiga funktionerna helt intakta. Lipider är fettmolekyler som finns i hela hjärnan och kroppen. I hjärnan hjälper de särskilt till att bilda cellmembran och ge hjärnan mycket av sin struktur. Lipider utgör en dubbel utmaning för biologisk studie, men eftersom de gör hjärnan till stor del ogenomtränglig både för kemikalier och för ljus.
Neuroscientists skulle ha velat extrahera lipiderna för att avslöja hjärnans fina struktur utan att skära eller snitta, men för en stor hitch: att ta bort dessa strukturellt viktiga molekyler får den återstående vävnaden att falla ifrån varandra.
tidigare undersökningar har istället fokuserat på att automatisera skiv – / snittningsmetoden eller vid behandling av hjärnan med organiska molekyler som endast underlättar penetrering av ljus, men inte makromolekylära sonder. Med tydlighet har Deisseroths team tagit ett fundamentalt annat tillvägagångssätt.
“vi drog på kemiteknik för att omvandla biologisk vävnad till ett nytt tillstånd som är intakt men optiskt transparent och permeabel för makromolekyler”, säger Chung, tidningens första författare.
denna nya form skapas genom att ersätta hjärnans lipider med en hydrogel. Hydrogelen är byggd inifrån hjärnan själv i en process som konceptuellt liknar förstening, med hjälp av vad som ursprungligen är en vattnig suspension av korta, enskilda molekyler som kallas hydrogelmonomerer. Den intakta, postmortemhjärnan är nedsänkt i hydrogellösningen, och monomererna infunderar vävnaden. Sedan, när” termiskt utlöst, ” eller upphettas något till omkring kroppstemperatur, monomererna börjar stelna i långa molekylära kedjor som kallas polymerer, bildar ett nät i hela hjärnan. Detta nät håller allt ihop, men det är viktigt att det inte binder till lipiderna.
med vävnaden shored upp på detta sätt kan laget kraftigt och snabbt extrahera lipider genom en process som kallas elektrofores. Det som återstår är en 3D, transparent hjärna med alla dess viktiga strukturer – neuroner, axoner, dendriter, synapser, proteiner, nukleinsyror och så vidare – intakta och på plats.
går saker en bättre
klarhet går då en bättre. För att bevara den fullständiga kontinuiteten i neuronala strukturer tillåter klarhet inte bara spårning av enskilda neurala anslutningar över långa avstånd genom hjärnan, men ger också ett sätt att samla rik, molekylär information som beskriver en cells funktion som inte är möjlig med andra metoder.
“vi trodde att om vi kunde ta bort lipiderna icke-destruktivt, skulle vi kunna få både ljus och makromolekyler att tränga djupt in i vävnaden, vilket möjliggör inte bara 3D-bildbehandling utan också 3D-molekylär analys av den intakta hjärnan”, säger Deisseroth, som innehar D. H. Chen-Professorn.
med hjälp av fluorescerande antikroppar som är kända för att söka och fästa sig endast till specifika proteiner visade Deisseroths team att det kan rikta sig mot specifika strukturer inom den KLARHETSMODIFIERADE eller “klargjorda” mushjärnan och göra dessa strukturer och endast dessa strukturer tänds under belysning. Forskarna kan spåra neurala kretsar genom hela hjärnan eller djupt utforska nyanser av lokala kretsledningar. De kan se förhållandena mellan celler och undersöka subcellulära strukturer. De kan till och med titta på kemiska förhållanden mellan proteinkomplex, nukleinsyror och neurotransmittorer.
en tredimensionell återgivning av klargjord hjärna avbildad underifrån (ventral halv). En fly-through video av gnagare hjärnan finns här.
“att kunna bestämma molekylstrukturen hos olika celler och deras kontakter genom antikroppsfärgning är en kärnförmåga av klarhet, separat från den optiska transparensen, vilket gör det möjligt för oss att visualisera relationer mellan hjärnkomponenter på fundamentalt nya sätt”, säger Deisseroth, som är en av 15 experter på “dream team” som kommer att kartlägga mål för $100 miljoner hjärnforskningsinitiativet som tillkännagavs April 2 av President Obama.
och i ännu en betydande förmåga ur forskningssynpunkt kan forskare nu avlägsna den klargjorda hjärnan, spola ut de fluorescerande antikropparna och upprepa färgningsprocessen på nytt med olika antikroppar för att utforska olika molekylära mål i samma hjärna. Denna färgning / destaining process kan upprepas flera gånger, författarna visade, och de olika datamängder i linje med varandra.
öppna dörren
klarhet har följaktligen gjort det möjligt att utföra mycket detaljerad, finstrukturanalys på intakta hjärnor-även mänskliga vävnader som har bevarats i många år, visade laget. Att omvandla mänskliga hjärnor till transparenta men stabila prover med tillgängliga ledningar och molekylära detaljer kan ge förbättrad förståelse för de strukturella underbyggnaderna för hjärnfunktion och sjukdom.
tredimensionell vy av färgad hippocampus som visar fluorescerande Uttryckande neuroner (grön), anslutande interneuroner (röd) och stödjande glia (blå).
utöver den omedelbara och uppenbara fördelen för neurovetenskapen varnade Deisseroth att klarhet har hoppat vår förmåga att hantera data. “Att förvandla massiva mängder data till användbar insikt innebär enorma beräkningsutmaningar som måste hanteras. Vi måste utveckla förbättrade beräkningsmetoder för bildsegmentering, 3D-bildregistrering, automatiserad spårning och bildförvärv”, sa han.
faktum är att sådana tryck kommer att öka eftersom tydlighet kan börja stödja en djupare förståelse av storskaliga intakta biologiska system och organ, kanske till och med hela organismer.
“av särskilt intresse för framtida studier är intrasystemrelationer, inte bara i däggdjurshjärnan utan också i andra vävnader eller sjukdomar för vilka full förståelse endast är möjlig när grundlig analys av enstaka, intakta system kan genomföras”, säger Deisseroth. “Klarhet kan vara tillämplig på alla biologiska system, och det kommer att vara intressant att se hur andra grenar av biologi kan använda den.”
andra medförfattare inkluderar Student Jenelle Wallace; graduate studentsung – yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin och Logan Grosenick; forskningsassistenter Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak och Charu Ramakrishnan; postdoktorala forskare Aaron Andalman, PhD och Tom Davidson, PhD; tidigare grundstudent Hannah Bernstein; och tidigare personalforskare Viviana Gradinaru.
forskningen stöddes av National Institute of Mental Health (grant MH099647); National Science Foundation; Simons Foundation; presidenten och Provost för Stanford University; de Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby och Yu stiftelser; DARPA reparationsprogram; och Burroughs Wellcome Fund.
Stanfords avdelning för Bioengineering stödde också arbetet. Institutionen drivs gemensamt av School of Engineering och School of Medicine.
