Gap junction protein Connexin-43 är en direkt transkriptionsregulator för N-cadherin in vivo

Embryo manipulation

vuxen X. laevis bibehölls vid 17 ACC C och användes enligt reglerna för den biologiska serviceenheten vid University College London, i enlighet med de brittiska hemkontorets riktlinjer som fastställs i Djurlagen 1986 som Beskrivet45. X. laevis embryon erhölls och iscensatt som tidigare beskrivts46,47. För att specifikt rikta sig mot neuralkammen injicerades embryon i djurens ventrala blastomerer vid åtta cellsteget på ena sidan för alla experiment, utom när embryonala lysater användes. I detta fall injicerades embryon i båda djursidorna av tvåcellstegsembryon. Embryo mikroinjektioner utfördes enligt48. Vid behov användes fluorescein-dextran (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) eller rhodamin-dextran (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) som spårämnen. Oligomorpholinos mot X. laevis Cx43( Cx43MO1; 8-24 ng, 5′ – TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5 ‘- AAAAATGGTTTTTTCTTGTGGGGTCGA – 3′) och BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′-Aacggaccgggtttaaaggcttcct-3′) syntetiserades och tillhandahölls av Gene Tools LLC. Ekvimolära koncentrationer av standardkontrollmorfolino (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5’) användes. Mängden morpholinos motsvarar de mängder som injiceras i ena sidan av åtta cellstegsembryon, medan den andra sidan användes som en intern kontroll. När embryon användes för insamling av embryonala lysater injicerades de i tvåcellssteg i båda djurblastomerer och dubbla av de nämnda doserna användes. För att testa effektiviteten hos Cx43MOs på den endogena cx43 mRNA utförde vi western blot-analys. Båda Cx43MOs sänkte effektivt proteinnivåerna för den endogena Cx43FL och Cx43iso (Fig. 3a, b). För att validera btf3mo-effektivitet testade vi genom immunfärgning av neurala crestceller btf3-proteinuttrycket, vilket visade minskade nivåer av BTF3 i btf3mo-celler jämfört med CTLMO (kompletterande Fig. 3a).

in situ hybridisering utfördes som tidigare beskrivet49, 50. I korthet fixerades embryon i MEMPFA, följt av hybridisering över natten med digoxigenin-märkta sonder, inkuberades med en AP-antikropp och AP-aktivitet utvecklades med användning av NBT/BCP-substrat. DIGOXIGENIN-märkta RNA-prober bereddes för foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) och sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0.8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml), och twist (0.7 µg/ml) användes för att bedöma neural crest induktion, twist (0.7 USC/ml) för neural crest migration, n-cadherin (1 USC/mL) för att bedöma uttrycksnivåer och btf3 (0,7 USC/mL) uttrycksmönster. Helmonterad immunfärgning utfördes som tidigare beskrivts55 med användning av cx43-antikropp (1: 1000, Sigma, C6219). I korthet fixerades embryon i MEPMFA och inkuberades över natten med antikroppen vid den beskrivna utspädningen.

Animal cap explants dissekerades från Xenopus blastulas (steg 8) med användning av en standardteknik48,56 och förberedd för in situ-hybridisering som beskrivits ovan. För djurkapsanalyser injicerades 500 pg mRNA i djursidan av de två blastomererna av tvåcellstegsembryon. Analys av ISH utfördes på 20-25 embryon per tillstånd för varje oberoende experiment.

neural crest manipulation och avbildning

Neural crest transplantationer utfördes som tidigare rapporterade57. Kortfattat dissekerades neurala vapen från steg 18 fluorescerande märkta embryon med ögonbrynsknivar och ympades i omärkta värdembryon. För in vitro-experiment dissekerades cranial neural crest explants vid steg 18 med användning av en standardteknik58,59 och pläterades på fibronektin (Sigma, F1141) belagda rätter som tidigare beskrivts53. För singelcellanalyser dissocierades neural crest-celler kort i Ca2+ / Mg2 + -fri Danilchick medium53. För varje tillstånd analyserades tio embryon transplanterade med fluorescerande märkt NC per experiment.

immunfärgning utfördes på neural crest explants som tidigare beskrivts54 med användning av anti-N-cadherin (1: 50, råtta IgG, klon MNCD2, DSHB), anti-E-cadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Avbildning av in vitro neural crest migration utfördes med användning av time-lapse cinematografi som beskrivits tidigare 53, 60. Kortfattat odlades neurala vapenceller i plast-eller glaspetriskålar belagda med fibronektin, och time-lapse-mikrokopi startades efter en timmes in vitro-kultur. För cellmotilitet och migration användes sammansatta mikroskop (antingen ett Eclipse 80I Nikon-mikroskop med en Hamamatsu-digitalkamera eller ett Dmrxa2 Leica-mikroskop med en Hamamatsu-digitalkamera som styrs av ett enkelt PCI-program) utrustade med motoriserade steg och en torrlins på 10 kg/0,30 NA. NC-kulturer framställdes såsom beskrivits ovan. Bilder förvärvades var 5: e minut under en period av 12 h. för bildbehandling av cellmorfologi användes ett TCS SP8–mikroskop med en 63 0,90 na-objektiv för nedsänkning av vatten och kontrollerad av LAS-AF-programvara. Fasta celler avbildades med användning av ett 63-mål för nedsänkning av olja /1.4 NA och ett Leica TCS SPE–konfokalt mikroskop kontrollerat av LAS-AF-programvara.

för konstruktlokalisering eller endogena IF-nivåer analyserades 10-15 NCC för varje tillstånd per experiment.

cellmigration och cellmorfologianalys

Kemotaxisanalys utfördes efter ett standardprocedur61 med användning av heparinakrylpärlor (Sigma, H5263) belagda med 1 kg/mL renad human stromal cell-härledd faktor-1 (Sigma, SRP3276). Cellmotilitet och kemotaxi analyserades med användning av ImageJ (https://imagej.nih.gov) analysverktyg, såsom beskrivits tidigare 53, 60. Kortfattat spårades varje enskild cell manuellt med hjälp av manuell Spårningsplugin för ImageJ, data samlades in och analyserades med hjälp av Chemotaxis-plugin för ImageJ. Cellmorfologi bedömdes genom att distribuera cirkularitetsindex (komplett cirkel = 1) och uppskattas av ImageJ-analysverktyg. Celldispersion analyserades med hjälp av Delaunay trianguleringsalgoritm (ImageJ Plugins) och plottades som genomsnittligt explant triangelområde, som beskrivits före54. Cellutskjutningsområdet analyserades i neurala krönceller vid kanten av en explant som mäter utväxningsområdet som härrör från två på varandra följande tidsramar med 4 min tidsintervall; dessa två på varandra följande ramar subtraherades för att generera det nya området12. För analys av cellkemotaxi och celldispersion analyserades 10-15 explanter Per tillstånd för varje oberoende experiment. För cellmotilitet analyserades cellmorfologi och cellutsprång 15-25 NCC Per tillstånd per experiment.

molekylärbiologi, plasmider och reagenser

för cDNA-syntes isolerades totalt RNA från 10-15 embryonsteg 23-24 eller 10-15 djurkapslar steg 8 från X. laevis per tillstånd för varje oberoende experiment och tre tekniska repliker användes inom varje experiment25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) som mall. Full längd Cx43 (Cx43FL, aa 1-379), Cx43 karboxi terminalt stympad konstruktion (Cx43Trunc, aa 1-212) och Cx43-20k konstruktion (Cx43Tail, aa 213-379) klonades i 5 ‘Bamhi/3’ Xhoi av pCS2+ eller pCS2-EGFP vektorer. PCS2-EGFP-vektorn tillhandahölls vänligt av Dr.Masa Tada. Inducerbar konstruktion av Cx43Tail bereddes genom att smälta Cx43-20ktail (aa 219-379) till den ligandbindande domänen för humant GR (aa 512-777). Cx43 – 20k klonades till 5 ‘EcoRI/3’ Saci och GR till 5 ‘Saci/3’ Xhoi av pCS2+ och pCS2-EGFP. Btf3-konstruktioner syntetiserades med användning av X. laevis sekvens från cDNA klon (UniGene ID XL. 3536). BTF3FL (aa 1-162) klonades till 5 ‘EcoRI/3’ Xhoi av pCS2+ eller pCS2-EGFP. Btf3-raderingskonstruktion som saknade NLS-regionen RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) klonades till 5 ‘Bamhi/3’ clai av pCS2+. För BiFC-experimenten (Fig. 4b, c), Cx43Tail och Cx43Trunc klonades till 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi av pCS2-VC155. BTF3FL klonades i 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi av pCS2-VN9m. BiFC vektorer var vänligt tillhandahålls av Prof James C. Smith. Alla konstruktionssekvenser verifieras genom automatiserad DNA-sekvensering (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); 213 CX43 (800 PG/embryo,63).

all analys på fluorescerande konstruktioner bedömdes genom normalisering till bakgrundsfluorescensen och vid behov till Total cellområde fluorescens.

följande reagenser användes: flufenamic syra (50 µM för NC explant inkubation −100µM för embryo behandling, Sigma, F9005), meclofenamic syra (50 µM för NC explant inkubation −100µM för embryo behandling, Sigma, M4531), actinomycin D (20 µM), Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) och etanol-upplöst dexametason (10 µM) lades till odlingsmediet på steg 14-15 och upprätthålls tills neural crest vandrande embryonala stadier (stadium 23). För att kontrollera det möjliga läckaget av inducerbara chimärer odlades en syskonparti embryon utan Dexametason och bearbetades för in situ hybridisering. För kopplingstest (testing gap junction channel activity) analyserades 10-15 NCC Per tillstånd per experiment.

Immunutfällning, fraktionering och western blotting

för varje tillstånd användes 10-15 embryon för beredning av embryolysater per experiment. Hela embryon bereddes för western blot efter homogenisering i lysbuffert (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) med tillsatta proteashämmare (Roche, 11836153001) och fosfatashämmare (Roche, 04906837001)54,64. För västerländska blottar användes följande antikroppar: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); i korthet suspenderades celler i lysbuffert och centrifugerades vid 20 000 kg i 5 minuter vid 4 kg C, supernatanten återvanns och volymen justerades med utspädningsbuffert. Pärlor jämvikts i utspädningsbuffert och blandades med det resuspenderade celllysatet. Blandningen renades magnetiskt och bereddes för western blot. Kärnfraktionsisolering av X. laevis-embryon utfördes med användning av differentiella centrifugeringsprotokoll med modifieringar64,65. Kortfattat, steg 18 X. laevis embryo lysates med användning av en 22 G nål och 20 occyll homogenisering buffert (HB: 250 mm sackaros, 20 mm Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, fosfatas och proteashämmare) per embryo. Alla prover centrifugerades vid 250 kg i 5 minuter för att avlägsna embryoavfall. Efter uppsamling av supernatanten fördelades den till tre olika rör och snurrade i tre olika hastigheter (400 kg, 600 kg) i 5 minuter för att isolera cellkärnorna. De postnuclear supernatanterna hölls för vidare bearbetning. Kärnpelletsna tvättades en gång till i buffert HG och centrifugerades med lämplig hastighet (400 kg, 600 g). Kärnpellets återsuspenderades sedan i 40 oc 10% glycerol/0,1% SDS / 1% Triton-X i HB. Lämplig mängd provbuffert tillsattes till varje prov och prover bearbetades för akrylamidgelelektrofores och western blot-analys. För att undvika laddningsfel blottades samma membran mot lastkontrollen efter strippning som beskrivits före54, 64.

Western blot-data analyserades med hjälp av ImageJ-analysverktyg. Bildintensiteter normaliserades och förhållandet mellan proteinet av intresse och belastningskontroll (dvs., Mapk eller Asia-tubulin) beräknades, genomsnittliga förhållanden plottades. Uncropped blots ingår som kompletterande siffror (kompletterande fikon. 5–7).

cellkulturer

HeLa-celler (Leibniz Institute Collections of Microorganisms and Cell Culture, Dsmz, Tyskland) odlades i DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum (Life Technologies, CA, USA) vid 37 kcal C i en fuktad atmosfär av 10% CO2 och transfekterades enligt indikationen med Rotifect (Carl Roth, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner.

Xenopus embryonala fibroblaster (XTC, en snäll gåva från Ana Losada) odlades i 67% DMEM/H2O kompletterat med 10% fetalt kalvserum vid 25 kcal C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 och transfekterades enligt vad som anges med Viafect (Promega, USA). Plasmider för transfektion var som indikerat och 10-20 Hela-eller XTC-celler analyserades för varje tillstånd per experiment.

för siRNA-experiment transfekterades en kombination av tre siRNA riktade mot BTF3 som beskrivits ovan. En standard siRNA (krypterad siRNA från Sigma) användes som kontroll. Katalognummer för dessa kommersiella siRNA mot BTF3 är: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Celler samlades 48 h efter transfektion och bearbetades för qPCR, western blot eller Immunohistokemetriska experiment. Som beskrivs i respektive avsnitt.

alla cellinjer testades för mykoplasmakontaminering.

Immunhistokemetri och falloidinfärgning

för proteindetektion fixerades däggdjursceller eller neurala vapenexplanter i 4% formaldehyd i 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton X-100) under 10 minuter och blockerades med 10% NGS under 1 timme. Primära antikroppar inkuberades på vid 4 kg i 10% NGS. Följande antikroppar användes: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 occurg/ml anti-n-cadherin (Mncd2 utvecklingsstudier Hybridoma Bank) och 1:100 anti-cx43 (Sigma, C6219) i 10% NGS och inkuberades på vid 4 oc C. Explanter tvättades 3 gånger med PBS + 0,2% Tween-20 och inkuberades på vid 4 oc C med sekundär antikropp, utspädd vid 1:350 i 10% ngs. DAPI späddes vid 1: 1000 och blandades med sekundära antikroppar.

masspektrometri

för samimmunutfällning av den FLAGGMÄRKTA Cx43Tail för masspektrometriska analysceller lysades och lysater inkuberades över natten med anti-HA och jämvikts högaffinitetspärlor vid 4 kcal C tvättades sedan immunutfällningarna och eluerades 27. Därefter av syra eluering med 0,1 M glycin pH 2,5 justerades pH för eluaten till pH 8,0 med 0,5 m Tris. För protein digestion prover inkuberades över natten med 2 occurg trypsin (Trypsin Gold, Promega, USA) följt av tillsats av 0.1 occurg Lys-C (Roche, Tyskland) och inkubation för ytterligare 6 h. peptiderna avsaltades på C-18 reverserade fasstegstips (Nest Group, USA), torkades i vakuum och lagrades vid -20 occur C tills analys. Torkade peptider blandningar utvanns i 3 occl 30% myrsyra och späddes med vatten till 23 occl. Fem acbill av digest injicerades på ett Nano – LC-system (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA) och peptider separerades genom omvänd fas kromatografi på C-18-kolumner som framställdes internt (Reprosil-Pur C18-AQ, 1.9 acbicm, Dr.Maisch, Tyskland, PicoFrit-kolumner, 75 acbicm i.d., New Obejctive, USA) i en linjär gradient av 100% eluent A (0,1% myrsyra) till 55% eluent B (60% actenitril, 0,1% myrsyra) på 120 min. LC-systemet ställdes in som ventilerad kolonn och provet belastades och avsaltades vid en flödeshastighet av 400 nl/min och separering utfördes vid en flödeshastighet av 200 nl/min. Nano – LC-systemet bindestreckades till masspektrometern (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Tyskland) som drivs i databeroende läge. Datatolkning utfördes med Mascot V2.2 (Matrixscience, Storbritannien) och Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, Storbritannien). Datatolkning utfördes med MaxQuant V1.6.1.0 och Perseus V1.6. 1. 3 (MPI för biokemi, Tyskland).

Kopplingsanalys

Gap junction intracellulär kommunikation testades med användning av en färgkopplingsanalys. Här användes det fluorescerande färgämnet Calcein-AM (Sigma, 17783). En neural crest-population dissekerad från oinjekterade embryon inkuberades med färgämnet Calcein-AM i ungefär 10 min eller tills färgämnet laddades in i alla celler. En annan neural crest-population från embryon injicerade med en kärnmarkör (nrfp mRNA-injektioner, se ovan) dissekerades separat. Efter att de två populationerna dissocierades i frånvaro av kalcium och magnesium, blandades de och inkuberades i 1 h vid 14 kcal C i ett provrör. Efter mild centrifug skars de neurala vapenexplanterna i bitar av liknande storlek och odlades som beskrivits ovan och filmades sedan. För att testa kanalaktiviteten hos gap-korsningar användes gap-korsningsblockerare; meklofenaminsyra (Sigma, M4531) och flufenaminsyra (Sigma, F9005). Cellkommunikation bedömdes genom att uppskatta förhållandet mellan antalet celler som visar både spårämnen, kärnmarkören och Kalceinet till det totala antalet celler som har kärnmarkören.

statistisk analys

uppskattningen av provstorleken gjordes genom att följa tidigare publicerat arbete och ingen specifik statistisk metod användes. Experiment randomiserades inte och på grund av experimentets natur blindades författarna inte till allokering under både experiment och resultatanalys. Endast livskraftiga embryon och explanter analyserades. Mis-injicerade embryon inkluderades inte för hybridiseringsexperiment på plats. Korrekt injektion bestämdes genom injektion av linjära spårämnen. Våra experimentella parametrar mättes slumpmässigt när livskraftiga och korrekt injicerade embryon valdes.

jämförelse av procentsatser utfördes med användning av beredskapstabeller66. Normalitet av datamängder testades med Kolmogorov-Smirnovs test, d ‘ Agostino och Pearsons test och Shapiro–Wilks test med Prism6 (GraphPad). Datauppsättningar efter normalfördelning jämfördes med studentens t-test (två-tailed, ojämlika avvikelser) eller ANOVA med ett Dunnetts flera jämförelser efter test med Excel eller Prism6 (GraphPad). Datauppsättningar som inte följde en normalfördelning jämfördes med Mann Whitneys test eller en icke-parametrisk ANOVA (Kruskal Wallis med Dunns multipla jämförelser efter test) med Excel eller Prism6. Korsjämförelser utfördes endast om det totala p-värdet för ANOVA var mindre än 0,05. I alla figurlegender N = antal oberoende experiment; n = total provstorlek.

X. laevis n-cadherin partiell promotoridentifiering

för att identifiera den grundläggande promotorn för Xenopus n-cad använde vi följande strategi. Den grundläggande promotorregionen från kyckling och däggdjur n-cadheringener har beskrivits vid 5′-utr-regionerna,inom positionen -3000 till -1 bp respekterar översättningsinitieringsplatsen 41, 67. Genom att använda X. laevis Genome Project resource (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) identifierade vi en region på 2800 bp i 5′-UTR av X. laevis n-cadherin-genen (kompletterande Fig. 4). Eftersom våra data indikerar att Cx43Tail, BTF-3 och Pol II bildar ett komplex använder vi ElemeNT tool68 för att söka efter potentiellt aktiva Tata-lådor i regionen som vi isolerade. Vår in silico-analys avslöjar en TATA-boxrik region mellan positionerna -166 till -618 bp, i förhållande till översättningsstartplatsen (kompletterande Fig. 4). Slutligen designar vi överlappande primers för att förstärka fragment av 200 bp över denna region. Primers sekvenser listas i Chipsektionen och deras bindningsregioner markeras i kompletterande Fig. 4.

kromatin immunutfällning (ChIP)

för kromatin immunutfällning (ChiP) följde vi ett standardförfarande för X. laevis embryos69, 70. För varje oberoende experiment använde vi två tekniska kopior och 250-300 Xenopusembryon per tillstånd. I korthet fixades neurula-steg X. laevis-embryon för 15 min och 3 occurg av Pol II-antikropp (Diagenode, C15100055) eller GFP-Chipkvalitetsantikropp (Abcam, ab290) användes. För DNA-extraktion följde vi ett standardprotokoll69, 70. Med hjälp av Elementanalysresursen sökte vi efter förmodade Tata-rutor i X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5 ‘- GCCAAGTTTTCCCTTTGTTGT-3’,

P8F: 5 ‘- GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3’,

P8R: 5 ‘- AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3 ‘

och deras relativa bindningsställen visas i kompletterande Fig. 4b. ChIP-experiment kvantifierades enligt följande: normaliserat förhållande mellan bandintensitet för varje tillstånd var i genomsnitt det och vikökningen respekterar IgG-kontrollen beräknades och plottades som vikberikning. Band intensitet registrerades med hjälp av ImageJ Gels analys plugin. Okroppade geler visas i kompletterande Fig. 7c, d.