genetisk analys av ett Poliovirus/hepatit C-Virus (HCV) Chimera: interaktion mellan Poliovirus klöverblad och en sekvens i HCV 5′ Nontranslated Region resulterar i en Replikationsfenotyp
abstrakt
interna ribosomala Inträdesställen (IRESS) kan fungera i utländska virala genom eller i artificiella DICISTRONISKA mRNA. Vi beskriver en interaktion mellan vildtyp hepatit C-virus (HCV)-specifik sekvens och poliovirus (PV) 5′ – terminal klöverblad i ett PV/HCV-chimärt virus (innehållande HCV-IRES), vilket resulterar i en replikationsfenotyp. Antingen en punktmutation vid nukleotid (nt) 29 eller en deletion upp till nt 40 i HCV 5′ icke-översatt region lindrade replikationsblocket, vilket gav PV/HCV-varianter som replikerade till höga titrar. Lyckosamma men förlamande interaktioner mellan en IRES och omgivande heterologt RNA måste beaktas när IRES-baserade dicistroniska uttrycksvektorer konstrueras.
alla picornavirusgenom innehåller ett genetiskt element som heter intern ribosomal entry site (IRES) som tillåter översättning av virala genomiska mRNA på ett 5 ‘ -och cap-oberoende sätt (5, 12, 13, 16, 20, 25). Liknande genetiska element har också upptäckts i Genom av hepatit C-virus(HCV) (24), ett Hepacivirus och bovint viralt diarrevirus (21), ett Pestivirus, av familjen Flaviviridae. IRESs är belägna i det 5 ‘ – terminala segmentet av genomerna, där de kontrollerar initiering av polyproteinsyntes. Vissa insekts-RNA-virus, t.ex. Plautia stalitarmvirus, är emellertid exceptionella genom att deras besläktade IRES kartlägger flera tusen nukleotider nedströms 5’ – änden av genomet och separerar två cistroner som kodar för två olika polyproteiner (23). Det är av intresse att vi tidigare har konstruerat ett dicistroniskt poliovirus (PV) genom att införa IRES av encefalomyokarditvirus i kodningsområdet för PV-polyproteinet (16). Den genetiska organisationen av denna dicistronic PV, som kodar för två polyproteiner separerade av ett IRES-element, liknar den hos P. stali-tarmvirus.
IRES-element definieras av funktion och inte av nukleotidsekvens. Faktum är att IRESs av PV, ett picornavirus och HCV, ett flavivirus, har liten eller någon sekvens gemensamt, men båda fungerar som promotorer av intern ribosomal post för initiering av översättning. Detta fenomen är mest uppenbart i chimära PV / HCV-virus där de kognata PV-IRES har bytts ut med HCV (15, 28). Oväntat innefattar HCV-IRES en sekvens nedströms AUG-kodonet som initierar sitt polyprotein (15, 22). Vid konstruktion av ett livskraftigt PV / HCV-chimärt virus var en del av kärnproteinkodningssekvensen nödvändig för att erhålla ett livskraftigt virus (Fig.1, Occusiccore) (15). Sekvensen leder till bildandet av en Polyprotein för fusion av en mikrokärna / PV som måste bearbetas genom klyvning av det virala proteinaset 2APRO PV vid korsningen av en mikrokärna*1a (Fig. 1) (28). Produktionen av kärnsekvenskodade peptider som härrör från translation av Aucluscore-sekvensen är emellertid inte nödvändig för funktionen av HCV-IRES i P/H710-d17* (28). (I tidigare studier betecknades P/H710-d17 p/H701-2a eftersom det chimära genomet innehöll den HCV-specifika sekvensen från nukleotider 18 till 710 av HCV-genomet . Numreringen av HCV 5 ‘icke-översatt region i detta dokument överensstämmer med numreringen av HCV 5’ NTR i full längd .)
