Genomomfattande analys av kondensinbindning i Caenorhabditis elegans

Kondensiner i och II delar de två SMC-underenheterna MIX-1 och SMC-4 och kännetecknas av tre icke-SMC-underenheter (Figur 1a). Kondensin IDC skiljer sig från kondensin I med endast en underenhet, SMC-4-varianten DPY-27. Vi använde en eller två olika antikroppar mot varje kondensinsubenhet för ChIP-seq och identifierade de bindningsställen som är vanliga i flera antikroppar och biologiska replikat (ytterligare fil 1: Tabell S1). Antikropp validering och förväntade samimmunutfällning interaktioner från condensin holocomplex presenteras i ytterligare Fil 2. Parvis korrelation av medianchip-anrikningspoäng grupperade kondensin i-IDC-och II-underenheter separat, vilket bekräftar fördelningen av enskilda underenheter mellan de tre kondensintyperna (Figur 1b).

högupplösta bindningsmönster för de tre kondensinkomplexen är liknande

C. elegans condensin I och II har delvis överlappande men olika kromosomala lokaliseringar i mitos och meios , och condensin IDC riktar sig specifikt till X . Därför förväntade vi oss att hitta olika ChIP-seq-mönster för kondensin i, IDC och II. istället var bindningsmönster för kondensin I, IDC och II-underenheter i allmänhet lika (figur 1C). Denna likhet berodde inte på antikroppskorsreaktivitet, eftersom HCP-6-antikroppen, som inte visar någon korsreaktivitet och inte immunoprecipiterar någon kondensin I-IDC-subenhet , visade omfattande samlokalisering med kondensin I-IDC-subenheter (se HCP-6 i Figur 1C). Dessutom, Om överlappningen av kondensin II berodde på korsreaktivitet med kondensin IDC, skulle vi ha förväntat oss en anrikning av kondensin II-bindningsställen på X, vilket inte var fallet (figur 1D). Jämfört med kondensin II hade kondensin IDC-subenheter konsekvent högre Chippoäng på X, vilket tyder på en skillnad i kromosomal association av de två kondensinkomplexen som fångats av ChIP (notera olika skalor på X och kromosom I i Figur 1C). Eftersom vi utförde ChIP-seq i blandade embryon, var de flesta cellerna (mer än 95% uppskattade med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) färgning) i interfas. Bristen på kondensin i-underenheter på autosomer (figur 1C och ytterligare fil 3: Figur S1A) och den tidigare observationen att kondensin i lokaliserar till mitotiska kromosomer efter kärnkuvertnedbrytning tyder på att det mesta av ChIP-seq-signalen är från interfas. Till stöd för detta visade sig kondensin II vara kärnkraft under interfasen och visade en mer jämn fördelning av bindningsställen bland alla kromosomer (figur 1D).

KLE-2, HCP-6 och CAPG-2 är kondensin II-specifika och representerar således kondensin II-bindning. Condensin I och IDC delar alla tre icke-SMC-underenheter, så hädanefter hänvisar vi till ChIP-seq-signalen från DPY-26, DPY-28 och CAPG-1 från condensin i-IDC. För att fokusera på de platser som är bundna som ett komplex, har vi i genomsnitt Chipsignalen från de specifika CAP-subenheterna av kondensintyp. Förutom att använda genomsnittliga data verifierade vi att varje analys var sant med enskilda underenheter, och vi presenterar HCP-6 och DPY-28 i kompletterande siffror. Vi identifierade en uppsättning kondensin i-IDC-och II-bindningsställen med högt förtroende genom att bara välja de ChIP-seq-toppar som var konsekventa över två eller flera icke-SMC-underenheter (figur 1D). Som tidigare nämnts inträffade 97% av kondensin i-IDC-bindningen på X-kromosomen . Kondensin II fördelades på liknande sätt mellan autosomer och X. Condensin II bunden till starkare kondensin I-IDC-platser på X-kromosomen (figur 1e och ytterligare fil 3: Figur S1B).

Kondensinbindningsställen berikas vid aktiva promotorer

för att identifiera de regioner där kondensiner företrädesvis binder, analyserade vi kondensinbindningsställen med avseende på flera genomiska anteckningar. Kondensinbindningsställen berikades signifikant vid promotorer, nära tRNA-gener och icke-kodande RNA (figur 2a, ytterligare fil 4: Figur S2). För att eliminera möjligheten att kondensinbundna tRNA-gener endast förekommer hos promotorer, tog vi bort tRNA-gener som var inom 1 kb av en transkriptionsstartplats (TSS) och bestämde att överlappningen av tRNA-och kondensinbindningsställen förblev signifikant (23% och 6% av tRNA överlappade med kondensin I-IDC respektive II-platser, p = 0.0002). Kondensinbindning vid tRNA-gener antyder att tfiiic-medierad kondensinrekrytering kan bevaras mellan C. elegans och jäst .

Kondensinställen berikas på promotorer och tRNA, och bindning korrelerar positivt med transkription. A) anrikning eller uttömning av kondensinbindningsställen vid olika genomiska anteckningar ges. Slumpmässig anrikning och p-värden beräknades genom ett permutationstest som slumpmässigt fördelade kondensintopparna 10 000 gånger. För både kondensin I-IDC och II finns det en signifikant anrikning av bindningsställen vid 1 kb-promotorer och nära icke-kodande RNA (P = 0.0002), utarmning inom genkroppar (transkriptionsstartplats (TSS) till transkriptionsslutplats (TES)) (P = 0,0002) och ingen signifikant anrikning eller utarmning vid 3′ av gener (P > 0,05). (B) Kondensinchipsignalen är inriktad på tsss för uttryckta gener (topp 25% av RNA-nivå, fasta linjer) och inte uttryckta gener (botten 25% av RNA-nivå, streckade linjer). De omgivande prickarna representerar 95% konfidensnivå. Som en kontroll ritas immunoglobulin G (IgG) Chipsignal vid TSSs I grått. (C) Spearman rank korrelationskoefficient mellan median ChIP-poäng vid 500 bp-promotorer och RNA-nivå vid respektive gener ges för hela genomet och X-kromosomen. Det finns en liten positiv korrelation mellan kondensinbindning och transkription. (D) Median ChIP-poäng inom 500 bp uppströms om TSS plottas mot RNA-nivån för varje gen. Kondensinpromotorbundna gener (definierade genom överlappning med en kondensinplats inom 1 kb av TSS) markeras i orange (kondensin I-IDC) och blått (kondensin II). (E) GC-innehållet i 50 bp-fönster är ritat över condensin I-IDC och II bindande toppmöten. Som en kontroll bestämdes GC-innehållet över 1500 slumpmässiga koordinater och plottades på samma sätt som de faktiska kondensintoppmötena. Genomsnittligt GC-innehåll är högt runt toppen av kondensinbindning.

Bindningen var högst inom 500 bp av TSS (ytterligare fil 5: figur S3A) och 45% av kondensin I-IDC och 62% av kondensin II-toppar var belägna vid promotorer. Kondensinbindning vid promotorer korrelerade positivt med transkriptionsaktiviteten hos nedströmsgenen (Figur 2B,C), men inte alla aktiva promotorer var bundna (figur 2D). Gen ontologi termanalys av bundna promotorer visade en liten (1,3-faldig) men signifikant (P = 3,5 e-17) anrikning för gener med embryoutvecklingsfunktion (ytterligare fil 6: tabell S2). Cirka 20% av starkt uttryckta gener (övre kvartilen med RNA-nivå) hade ett kondensin II-bindningsställe inom 1 kb och cirka 70% av X-kromosomgener hade ett kondensin i-IDC-bindningsställe inom 1 kb. Därför, även om transkriptionsaktivitet är viktig, är det inte tillräckligt att förklara specificiteten av kondensinbindning vid vissa promotorer.

vi märkte att alla kondensinbindningsställen visade en framträdande anrikning av GC-innehåll jämfört med omgivande regioner och slumpmässiga koordinater (figur 2e). I C. elegans är GC-innehållet i X-kromosompromotorer högre än för autosomala promotorer . Det är möjligt att högre GC-innehåll är en DNA-sekvensfunktion för kondensinbindning, och X-promotorer utvecklades för att innehålla högre GC-innehåll för att stödja kondensin IDC-bindning.

Kondensinbindningsställen sammanfaller signifikant med en delmängd av transkriptionsfaktorer

för att bestämma ytterligare faktorer som skiljer kondensinbundna promotorer jämförde vi kondensin-och TF-bindningsställen och hittade en delmängd av TFs som binds till samma promotorer som kondensiner (figur 3a). Tidigare studier visade att flera TFs binder till en uppsättning bindningsställen med hög beläggning (HOT) . Det fanns en överlappning på 5% och 22% av kondensin i-IDC och kondensin II-platser med heta platser (P = 0,0002). Betydelsen av överlappning med TFs förblev densamma när heta platser eliminerades från analysen (ytterligare fil 5: figur S3B). Procentsatser av överlappning för varje TF berodde på antalet bindningsställen, och visas i ytterligare fil 5: figur S3C. bland enskilda TFs, fann vi att 69% av kondensin II platser och 53% av LIN-13 platser överlappade med varandra, vilket gör LIN-13 toppen TF som signifikant överlappade med kondensin II.

Kondensin II-bindning överlappar med transkriptionsfaktorer icke-slumpmässigt, och uttrycksanalys antyder en repressiv funktion för kondensin II. (a) Transkriptionsfaktorställen från modekod rankas efter vikberikningen av överlappning med kondensinbindningsställen. Vikberikning bestäms som förhållandet mellan procentuell överlappning i observerad kontra genomsnitt av slumpmässiga fördelningar av kondensinställen 10 000 gånger över genomet. Resultaten indikerar att kondensinbindning inte är slumpmässig med avseende på TF-bindningsställen. (B) Venn-diagram visar överlappningen av kondensin II-bindningsställen med LIN-13 (modecode_3342, embryon) och LIN-35 (modecode_3925, sena embryon) (överst), endast med LIN-13 (längst ner till vänster) och endast med LIN-35 (längst ner till höger). Andelen överlappning mellan kondensin II och LIN-13 och LIN-35 är högre på platser som upptas av båda proteinerna. Den givna överlappningen representerar antalet kondensin II-toppar som överlappar varandra med respektive LIN-13 och LIN-35-platser. C) Genomsnittlig Chip-SEQ-anrikning från condensin II, LIN – 13 och LIN-35 ritas över toppen av varje condensin II-topp. Kondensin II bindningsställen är indelade i fyra grupper. Toppgruppen består av kondensin II-bindningsställen som överlappar LIN-13 och LIN-35, den andra överlappar endast LIN-13, Den tredje med LIN-35 endast och den sista gruppen överlappar inte LIN-13 eller LIN-35. Topparna minskar beställda baserat på deras chipberikning. Ett stort antal kondensin II-platser visar hög LIN-13, men inte LIN-35, bindande. Kondensin II-bindning är starkare på platser bundna av både LIN-13 och LIN-35. (D) differentiell expressionsanalys (RNA-seq) i kle-2 noll heterozygot kontra homozygot larvstadium 2/3 (L2/L3) larver. Proportionerna av gener bundna eller obundna med KLE-2 med ökning eller minskning av transkriptnivå i homozygot mutant visas. Transkriptnivåer av proportionellt fler gener ökar i kle-2 mutant. TF, transkriptionsfaktor.

Lin – 13 har ett retinoblastomprotein (pRb) interaktionsmotiv och fungerar i vulvalutveckling med den enda pRb-homologen LIN-35 i C. elegans . I D. melanogaster reduceras kondensin II-subenheten dCAPD3-bindning till kromatin vid pRb-mutation . Om, i C. elegans, LIN-13 rekryterar condensin II genom LIN-35, Då de LIN-13 platser som också är bundna av LIN-35 (576) bör överlappa med condensin II mer än de LIN-13 platser som inte är bundna av LIN-35 (1,033). Överlappningen av LIN-13 och LIN-35 samockuperade platser med kondensin II-platser var bara något högre än för LIN-13-platser utan LIN-35, 60% respektive 50% (figur 3b). Omvänt var överlappningen av LIN – 35 med kondensin II högre vid de platser som också var bundna av LIN-13 (45%) jämfört med obundna platser (9%). Detta tyder på att den potentiella interaktionen mellan LIN-13 och condensin II är mestadels LIN-35 oberoende. LIN – 35 fungerar inom ett konserverat multiproteinkomplex som kallas DRM i C. elegans (hDREAM hos människor) som också innehåller EFL-1 och DPL-1 . De 555 DRM-bindningsställen som var bundna av LIN-13 visade en större överlappning med kondensin II (63%) jämfört med 787 DRM-platser som inte var bundna av LIN-13 (13%). Vi delade kondensin II-platserna i fyra grupper enligt bindningsstället överlappning med LIN-13 och LIN-35 (figur 3C). Denna gruppering indikerade att ett stort antal kondensin II-platser visar hög LIN-13-bindning, men inte LIN-35, vilket tyder på att om pRb-medierad rekrytering av kondensin II bevaras i C. elegans, LIN-35 kan bero på närvaron av LIN-13 för rekrytering av kondensin II.

Kondensin II-mutation orsakar transkriptionsdefekter som antyder en repressiv funktion

i jäst och D. melanogaster har kondensin varit inblandad i transkriptionsförtryck . En ny studie i D. melanogaster indikerade att kondensin II-subenheten CAPD3 krävs för transkriptionsaktivering av ett kluster av antimikrobiella peptidgener . För att förstå kondensin II: s roll i transkriptionsreglering utförde vi RNA-seq i kle-2 null mutant L2/L3 larver. Maternellt laddad KLE – 2 tillåter kle-2 null mutant (ok1151 allel) att växa upp för att vara sterila vuxna. Vi jämförde genuttryck i heterozygota och homozygota kle-2-mutanter i L2 / L3-larver innan groddlinjen sprids och innehåller således nästan helt interfaskärnor. Differentiell expressionsanalys med DESeq2 identifierade 356 gener vars uttryck var signifikant olika i homozygot jämfört med heterozygotlarver (falsk upptäcktshastighet < 5%; deseq2-resultat presenteras i ytterligare fil 7: tabell S3). Majoriteten av differentiellt uttryckta gener ökade (70%) snarare än minskade (30%) i uttryck. Gen ontologi termanalys avslöjade inte en viss grupp gener som påverkades av KLE-2-mutationen. I likhet med publicerade data för kondensin IDC fanns det ingen direkt korrelation mellan kle-2-bindning och förändringar i genuttryck. Det är viktigt att bland de 46 differentiellt uttryckta och KLE-2-bundna generna ökade 83% i uttryck jämfört med 67% av 310 gener som inte var KLE-2-bundna (figur 3D), vilket tyder på att den direkta effekten av kondensin II-bindning till stor del är repressiv.

Histonmodifieringar associerade med öppet kromatin korrelerar positivt med kondensinbindning

för att förstå kromatinkontexten för kondensinbindning analyserade vi förhållandet mellan kondensinbindningsställen och kromatinfunktioner mappade av modekod . Vi observerade en allmän positiv korrelation mellan kondensinbindning och märken av aktivt kromatin. I jäst korrelerar antalet kondensinbindningsställen genom hela cellcykeln direkt med kromosomlängd. Antalet C. elegans condensin II bindningsställen var inte proportionell mot kromosomlängd (figur 4A), men positivt korrelerad med längden av kromosomer associerade med aktiva histonmärken (figur 4b). X-kromosomen var ett undantag, kanske på grund av doskompensationsmekanismerna som förändrar dess kromatin . Kondensin i-IDC och II-bindning över genomet korrelerade positivt med öppna kromatinmärken såsom H3K27ac och negativt med heterochromatinmärken såsom H3K27me3 och H3K9me3 (figur 4C och ytterligare fil 8: figur S4). Denna korrelation var på domänomfattande nivå (som analyserades i 1 kb windows), eftersom vi inte såg en viss histonmodifiering som toppade vid kondensinställen i en metagen-typ av analys (data visas inte). I immunofluorescensstudier överlappade centromerproteiner med kondensin II-bindning i mitotiska celler . Vi observerade inte en positiv korrelation mellan CENP-A och condensin II ChIP-seq-signaler i embryon i blandat stadium, vilket tyder på att det i interfaskärnor (de flesta kärnor i embryoceller i blandat stadium) inte finns någon överlappning. Alternativt, med tanke på att CENP-A binder till endast en liten delmängd av CENP-a-positiva regioner i genomet per cell , kan överlappningen av CENP-a med kondensin II endast vara uppenbar i enstaka celler. För att förstå vilka kromatinfaktorer som bäst förutsäger kondensinbindning använde vi en maskininlärningsmetod. I C. elegans är H4K20me1 mycket berikad över X-kromosomen av DCC, och därmed var H4K20me1 den mest diskriminerande faktorn för kondensin IDC-bindning (figur 4D). För kondensin II är mycket prediktiva kromatinfunktioner H3K27ac och CBP, båda markörerna för aktiva förstärkare, vilket tyder på att kondensinbindning berikas vid aktiva förstärkare . Bland 201 kondensin II-bindningsställen som var 2 kb bort från en kommenterad TSS, överlappade 58 med en CBP-bindningsplats (P = 0.0002).

Kromatinfaktorer associerade med öppet kromatin och förstärkare korrelerar positivt med kondensinbindning. (A) antalet kondensin II-toppar ritas med avseende på den linjära längden på varje kromosom. (B) antalet kondensin II-toppar plottas mot längden på kromosomen som täcks av h4k8ac-och H4K16Ac-toppar. En trendlinje anpassad till autosomala data indikerar en positiv korrelation (R2 = 0,9). (C) Kondensinbindning inom 1 kb sammanhängande fönster över X-kromosomen (vänster) och autosomer (höger) korrelerar positivt med aktiva märken (till exempel H3K27ac, H2A.Z) och korrelerar negativt med repressiva märken (till exempel H3K27me3, H3K9me3). (D) en ensembleklassificerare (slumpmässiga skogar) lärde sig att förutsäga kondensinbindning över genomet. De 20 bästa funktionerna (bland totalt 92 funktioner, ytterligare fil 1: Tabell S1) med den högsta prediktiva effekten ritas för condensin i-IDC (vänster) och condensin II (höger) med den viktigaste funktionen ovanpå. Funktionerna rankas baserat på den genomsnittliga minskningen i noggrannhet, som beskriver skillnaden mellan felfrekvensen för den faktiska klassificeringen och felfrekvensen efter permutering av funktionen, i genomsnitt över alla klassificerare (träd).

DNA-sekvensmotiv berikade vid kondensinbindningsställen visar specifika egenskaper

även om kondensin II bundet till kondensin I-IDC-platserna på X, binder kondensin I-IDC inte till de flesta av de autosomala kondensin II-bindningsställena (figur 1D). För att förstå specificiteten av condensin IDC och II rekrytering sökte vi efter DNA-sekvensfunktioner som skiljer condensin II och condensin IDC-bindning. Tidigare studier har visat att kondensin IDC först rekryteras till cirka 100 platser och sprider sig sedan till andra kromosomala platser . Ett 10 bp DNA-sekvensmotiv berikades vid condensin IDC-rekryteringsplatserna (figur 5A) och mutation av motivet avskaffade condensin IDC-rekrytering på extrakromosomala matriser , vilket indikerar att condensin IDC DNA-sekvensmotivet spelar en viktig roll i condensin IDC-rekrytering.

vi hittade ett GCGC-innehållande DNA-sekvensmotiv som berikades under kondensin II-bindningsställen (figur 5A). Det är intressant att notera att både condensin II och condensin IDC-motivet inkluderade gcgc-kärnan, men condensin IDC-motivet förlängdes på ena sidan av AGGG, vilket tyder på att X-specificitet av condensin IDC-rekrytering uppnås genom kofaktorer som känner igen AGGG. Genomomfattande var 11% av kondensin II-motiven bundna av kondensin II. sålunda, i likhet med andra TFs (till exempel), var endast en del av de potentiella DNA-sekvensmotiven bundna av kondensin II. andra faktorer såsom kromatin tillgänglighet och okända kofaktorer kan vara involverade i bindande specificitet. Om vi tog de motiv som fanns i ett 2 kb-fönster som var väsentligt berikat för ett aktivt histonmärke, såsom H4K16ac, ökade andelen motiv som var bundna från 11% till 29%. Dessutom, som liknar condensin IDC-motiv , som är mer grupperat på de bundna platserna, fann vi att 1 kb genomiska fönster som innehöll mer än ett condensin II-motiv var cirka 2,5 gånger mer benägna att vara bundna av condensin II, jämfört med de med endast ett motiv. Därför hjälper motivklustring och öppen kromatinkontext att ange val av motiv som är bundna.

kromosomal rekrytering av kondensin IDCand kondensin II involverar både delade och distinkta regulatorer. (A) Motivlogotyper av 10 bp DNA-sekvensmotiv berikade på de övre kondensinställena visas. (B) överlappning mellan bindningsställen för kondensin i-IDC, kondensin II och SCC-2 visas. Siffror under varje faktor anger det totala antalet bindningsställen. Överlappande siffror baseras på antalet SCC-2-toppar. (C) University of California Santa Cruz (UCSC) webbläsarvy exemplifierar SCC-2 ChIP-seq-signal, som mestadels är begränsad till promotorer. (D) SCC-2 och condensin II-bindning vid en väldefinierad condensin IDC-rekryteringsplats på X (rex-1). (E) i sdc-2 nollmutant (TY1072), kondensin I-IDC (DPY-26), kondensin II (HCP-6, KLE-2) och SCC-2-bindning minskar vid rex-2 (vänster panel), men förblir i stort sett lika på autosomer (höger panel). (F) Box plot av förhållandet mellan Chip anrikning i sdc-2 mutant kontra vild typ inom bindande toppar SCC-2. Bindningsställen klassificeras som på autosomer, på X med låg SDC-2-bindning och hög SDC-2-bindning. (G) qPCR-analys av DPY-27-chipberikning i embryon isolerade från vuxna som matades vektor (kontroll) och PQN-85 RNAi. ChIP anrikning uttrycks som i förhållande till den negativa kontroll locus. Felstänger är standardavvikelserna från tre till fem biologiska replikat. ChIP, kromatin immunoprecipitation; DCC, doseringskompensationskomplex.

inte alla kondensin II-bindningsställen har motivet. Vid dessa kondensin II-platser utan motivet kan andra faktorer vara ansvariga för bindning. Alternativt kan den låga andelen kondensin II-platser (27%) som innehåller ett motiv förklaras av potentiell spridning av kondensin II efter rekrytering. Spridningsplatser förväntas inte innehålla motivet. Till exempel för condensin IDC innehåller en hög andel potentiella rekryteringsplatser (56%) motivet, men inte spridningsplatser (8%) . En systematisk analys av rekryteringskapaciteten hos de identifierade kondensin II-platserna behövs för att ta itu med om det finns någon spridning.

SDC – 2 krävs för bindning av kondensin I-IDC, kondensin II och cohesin loader till X-kromosomala DCC-rekryteringsställen

i metazoaner är proteiner som är involverade i kondensinrekrytering till kromosomer inte väl förstådda. I jäst överlappar kondensinbindning med det för kohesinbelastande komplex Scc2 / 4, vilket ökar kondensinföreningen med kromosomer . För att testa om överlappningen med Scc2 / 4 bevaras mellan jäst och C. elegans, vi utförde ChIP-seq-analys av SCC-2 (Även känd som PQN-85) och fann att en anmärkningsvärd 95% av SCC-2-platser överlappade med condensin I-IDC på X och 60% med condensin II genombrett (figur 5B). Överlappningen förblev likartad när heta områden uteslöts (ytterligare fil 9: figur S5A). Inte alla kondensinställen överlappade med SCC-2, vilket tyder på att kondensin, till skillnad från jäst, inte beror på SCC-2 för bindning . SCC – 2-bindning var högre vid promotorer och korrelerade positivt med transkription (ytterligare fil 9: figur S5B). Ett GAGA-innehållande DNA-sekvensmotiv var närvarande i 58% av SCC-2-bindningsställen (ytterligare fil 9: figur S5C). Till skillnad från Drosophila Nipped-B, och liknande S. cerevisiae Scc2, var SCC-2-bindningen inte hög inom transkriberade regioner, men förblev intergenisk (figur 5C).

nästan fullständig överlappning (96%) av kondensin II-bindningsställen med kondensin I-IDC på X-kromosomen stöder förekomsten av vanliga mekanismer för kromosombindning av olika kondensiner. Eftersom condensin II och SCC-2 bunden till condensin IDC rekryteringsplatser på X (figur 5D och ytterligare fil 9: Figur S5D) antog vi att condensin IDC-rekryterare också rekryterar condensin II och SCC-2. Hermafrodit-specifik rekrytering av kondensin IDC till X-kromosomen åstadkommes av SDC-2, SDC-3 och DPY-30 . Vi utförde HCP – 6 och KLE-2 (condensin II), DPY-26 (condensin i-IDC) och SCC-2 ChIP-seq i sdc-2 null mutant embryon. I sdc-2-mutanten avskaffades DPY-26, HCP-6, KLE-2 och SCC-2-bindningen vid en X-specifik condensin IDC-rekryteringsplats (rex-2) (Figur 5E). Det är oklart varför HCP – 6 och KLE-2-bindning vid rex-2 minskade istället för att likna ett autosomalt kondensinställe. SCC-2-bindning på autosomer och X-kromosomställen som är oberoende av SDC-2 förblev liknande i sdc-2-mutanten jämfört med platser som var bundna av SDC-2 (Figur 5F). Våra resultat tyder på att SDC-2, den hermafroditspecifika TF som rekryterar condensin IDC till X-kromosomen, rekryterar också condensin II och cohesin loading complex subenhet SCC-2 till samma platser (ytterligare fil 10: figur S6). Tidigare genetiska studier visade att en sdc-2-nollmutation inte orsakar embryonal dödlighet hos män, varför funktionen av kondensin II och SCC-2-rekrytering av SDC-2 inte är nödvändig för allmän kromosomkondensation och segregering . Det är möjligt att SCC-2 och condensin II rekrytering av SDC-2 har en hermafroditspecifik genreglerande funktion.

för att testa om SCC-2 har en effekt på kromosomal association av kondensin IDC på rekryteringsplatsen utförde vi kvantitativ PCR-analys av DPY-27 ChIP i kontroll kontra SCC-2 knockdown embryon. Genom att mata RNAi kunde vi slå ner nivåerna av SCC-2 med cirka 80% (ytterligare fil 9: figur S5E). Vid SCC – 2 knockdown såg vi inte någon signifikant förändring i DPY-27-bindning vid rex-1 eller rex-2 (Figur 5G). Konsekvent visade immunofluorescensanalys av kondensin i-och II-bindning på meiotiska kromosomer inte någon signifikant skillnad mellan vildtyp och scc-2-mutanter .