hur man designar gRNA för CRISPR genomredigering?

gRNA leder CRIPR Cas9-systemet till rätt genomisk plats för att utföra en dubbelsträngbrytning.Den targerting specificiteten av CRISPR Cas9-systemet bestäms av de 20 nukleotiderna vid 5′ – änden av gRNA. GRNA-basparet till den komplementära strängen i målsekvensen och Cas9-nukleas utför en dubbelsträngbrytning.

när du utformar en gRNA måste följande saker beaktas.

1) GC-innehåll: Typiskt intervall är mellan 40% – 80%. Ett högre GC-innehåll stabiliserar RNA-DNA-duplexen medan destabiliserar hybridiseringar utanför målet

2) Längd: längden kan justeras och sträcka sig från 17-24 baspar. En kortare sekvens leder till minimerade off-måleffekter. (17 bp är den lägsta gränsen för längden på styrsekvensen, vilken längd som helst av styrsekvensen vilken längd som helst kortare än 17 har en statistisk chans att rikta sig mot flera genomiska loci.)

3) potentiella off-target-effekter: Mismatch tolerans och målplatsen är det som leder till off-target-effekter. Detta kan minskas genom genom-wideoff-måleffektsökningar.

det finns många webbplatser som hjälper till att utforma gRNAs. Några av dem är Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgRNA designer och Biotools.

jag förklarar hur man använder Chop Chop webbplats här,

1) Gå till https://chopchop.cbu.uib.no/

2) Välj Art

3) Välj artspecifik gen-id eller klipp och klistra in nukleotiden av intresse och starta analys.

när analysen är klar visas grafisk representation av platsspecifik gRNA. Varje potentiell gRNA kommer också att visa de möjliga off-måleffekterna. Välj de med mindre off-måleffekter.