injicerbara humana rekombinanta kollagenmatriser begränsar negativ ombyggnad och förbättrar hjärtfunktionen efter hjärtinfarkt

studiedesign

här genomförde vi en studie för att (i) utforma kliniskt relevanta kollagenhydrogeler med hjälp av rekombinanta humana kollagener typ i och typ III; (ii) karakterisera och jämföra de fysiska egenskaperna hos rHCI och rhciii material; (iii) utvärdera materialets terapeutiska potential för behandling av MI hos möss och (iv) identifiera mekanismer som ligger till grund för de observerade terapeutiska effekterna av rHC-behandling. För in vivo-experiment valdes LAD-artärligering hos möss som en kliniskt relevant och väletablerad djurmodell av MI. För funktionella, histologiska och molekylära utvärderingar minimerades antalet djur per grupp till tre till femton möss, som anges i figurlegenderna. Möss tilldelades slumpmässigt till behandlingsgrupper och alla analyser utfördes på ett blindat sätt.

beredning och karakterisering av rHC-matriser

en 1% kollagenlösning framställdes genom upplösning av 0,1 g lyofiliserat kollagen (rHCI och rHCIII, från Fibrogen) i 10 ml ultrarent ddH2O. kondroitinsulfat (CS; Wako), n-etyl-N-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) och N-hydroxisuccinimid (NHS) tillsattes till producera en slutlig blandning med ett massförhållande av 1:4:0,5:0,3 för kollagen:cs:NHS:EDC. Materialen framställdes på is med hjälp av ett slutet system som tillåter homogen blandning utan tillsats av bubblor. Efter noggrann blandning justerades pH till 7.4 av NaOH (1.0 N). Matriser utan CS bereddes på liknande sätt men med PBS tillsatt för att kompensera för volymen av CS. Matriser märkta med Alexa-Fluor 594-NHS framställdes genom tillsats av 20 occyl av färgämneslösningen (1 mg/mL i DMSO) till gelerna innan tillsats av NaOH (25 nmol färgämne per hydrogel), följt av 20 blandningssteg.

materialviskositet

Viskositetsmätningar utfördes med användning av en Brookfield R / s Plus-rheometer (Brookfield) vid 37 kg C. En C25–2/30 konisk spindel användes för att komprimera materialet (50 kg förskjutning) på en temperaturstyrd piedestal. Viskositeten mättes med ett ramprotationsblock med en hastighet av 1/min enheter förinställda med en skjuvhastighet på fem enheter över en tid av 30 min.

grad av tvärbindning

Differential scanning calorimetry (DSC) experiment utfördes för att bedöma graden av tvärbindning. I korthet utfördes mätningar i en q2000 differentialscanningkalorimeter (ta−instrument) i intervallet 8 till 80 c-c med användning av en skanningshastighet på 5 C-1-C. Kollagenmatriser (5-20 mg) yttorkades med filterpapper och hermetiskt förseglades med ett aluminiumlock (Tzero; Ta-instrument) i en aluminiumprovpanna (Tzero; TA-instrument). Denatureringstemperaturen (Td) mättes vid början av den endoterma toppen.

vatteninnehåll

vatteninnehållet i materialen mättes genom vägning av provets våtvikt (W0), jämvikts i PBS för 96 h vid 4 kg C. Materialet vakuumtorkades sedan vid rumstemperatur i 96 h för att erhålla torrmassan (W). Hydrogelernas totala vatteninnehåll (Wt) beräknades sedan enligt ekvationen:

nedbrytning

enzymatisk nedbrytning mättes med användning av 50-100 mg hydrogel placerad i 5 ml av typ i-kollagenas (10 U/ml i PBS) vid 37 kcal C. Den återstående fasta massan mättes under en period av upp till 24 timmar. nedbrytningshastigheten beräknas från den initiala lutningen av tomterna med återstående massa vs. tid och rapporteras som mg/min.

Materialporositet

Lågtemperaturscanningelektronmikroskopi (Cryo-SEM) mätningar utfördes vid -50 kcal C med användning av en Tescan (Modell: Vega II – XMU) utrustad med en kallstegsprovhållare, en backscatter-elektrondetektor (BSE) och en sekundär elektrondetektor (SE). Porstorlekar mättes från minst 250 individer från 4 till 6 slumpmässiga områden av provet med hjälp av ImageJ-programvara för användning. Diameter för porer kvantifierades med användning av porens längdaxel med hjälp av det raka Linjeverktyget. Området av bilden justerades mot storleken skala bar erhållits från Tescan Vega II system65.

djurförsök

alla procedurer godkändes av University of Ottawa Animal Care Committee och utfördes enligt National Institute of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur.

MI-modell

MI inducerades i 9 veckor gamla kvinnliga C57BL/6-möss (Charles River; antal möss / grupp finns i figurlegenderna) och behandlingsleverans utfördes med användning av ett etablerat protokoll26,27. Möss bedövades (2% isofluran), intuberades och hjärtat exponerades via fjärde interkostal thorakotomi. Den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD) ligerades sedan strax under dess uppkomst från vänster atrium. Denna procedur resulterar i en stor MI som involverar de anterolaterala, bakre och apikala delarna av hjärtat, vilket bekräftades vid operationen genom myokardiell blanchering i regionen som levereras av artären. Kortverkande buprenorfin administrerades minst en timme före operationen och långverkande buprenorfin administrerades subkutant omedelbart före operation för perioperativ analgesi. Vid 1 vecka efter MI (baslinje) tilldelades möss slumpmässigt för att få behandling av PBS (kontroll), rHCI eller rHCIII matriser, levererade i fem ekvivolumetriska intramyokardiella injektioner (10 oc varje plats, 50 oc totalt) genom en 27-g nål med hjälp av en ultraljudsstyrd sluten bröstprocedur. Sprutan är fastsatt i en mikromanipulator (VisualSonics), och före injektionsproceduren är både nål-och RMV-scanhead-sonden inriktade längs hjärtaxeln. Via ultraljudsfältet används mikromanipulatorn för att placera nålspetsen på önskad plats i myokardiet för leverans av injektionerna (se kompletterande Fig. 1 och kompletterande Video 1). Möss dödades av terminal anestesi vid 2 dagar eller 4 veckor efter behandling och hjärtan samlades in för histologi och/eller mätningar av de mekaniska egenskaperna.

ekokardiografi

transtorakal ekokardiografi utfördes på långaxliga vyer med användning av ett Vevo770-system i b-läge med en 707b-serie realtids mikrovisualiseringsskanningshuvudsond (VisualSonics). Avbildningen utfördes vid baslinjen före behandlingsinjektion (7 dagar efter MI) och vid 28 dagar efter injektion för att bestämma vänster ventrikulär ejektionsfraktion (LVEF), fraktionerad områdesförändring (FAC), slut-systolisk volym (ESV), slutdiastolisk volym (EDV), slagvolym och hjärtutgång. Observera att LVEF, ESV och EDV används som kliniska prediktorer för HF och överlevnad efter MI44.

ex vivo-avbildning av Alexa-Fluor 594-märkt matris 5654 >

de kemiskt märkta rHC-matriserna (25 nmol färgämne per hydrogel) injicerades i det infarkt mushjärtat, såsom beskrivits ovan. Djur dödades vid 2 h, 2 dagar och 7 dagar efter behandlingen, och hjärtan skördades och avbildades ex vivo av Ivis except-spektrum (PerkinElmer) för att visualisera rHCI-och rHCIII-distribution i hjärtan (ubisexcitation: 570 nm; ubikemission: 640 nm). För histologi framställdes vävnadssektioner i aceton och färgades sedan med DAPI följt av avbildning med användning av en Leica Aperio Versa slide-skanner med en slutlig förstoring av 20 20 och en Z-stapel med åtta steg vid 1,5 occurm.

Stamanalys

Transthoracic ekokardiografi utfördes på långaxliga vyer med användning av ett Vevo3100-system i b-läge med en mx400-serie realtids mikrovisualisering scanhead sond (VisualSonics). Avbildningen utfördes vid baslinjen före behandlingsinjektion (7 dagar efter MI) och vid 2 dagar efter injektion för att bestämma longitudinell endokardiell stam vid tiden för aortaklaffstängning (representerar slut systole). Stam i Segment 5 (det främre mittsegmentet), motsvarande gränsområdet som är inriktat på behandlingsinjektion, analyserades med Vevostrain-applikationen av Vevo LAB 3.1.1-programvara (VisualSonics)41. Representativa exempel på utförda mätningar ingår i kompletterande Fig. 10 för alla försöksgrupper plus ett friskt (icke-infarkt) djur.

elektrokardiografi

elektrokardiogram erhölls samtidigt med ekokardiografi med användning av ett Vevo3100-system (VisualSonics) vid baslinjen före behandlingsinjektion (7 dagar efter MI) och 2 dagar efter injektion. Elektrokardiogram exporterades från Vevo LAB 3.1.1. programvara (VisualSonics). Längden på PR -, QT-och QRS-intervallen bestämdes med hjälp av ImageJ-programvara (kompletterande Tabell 1).

mekaniska egenskaper hos myokardiet

möss euthaniserades genom terminalbedövning 2 eller 28 dagar efter behandlingen, och hjärtan skördades. Rektangulära bitar (2,5 5 mm i den vänstra ventrikeln innefattande ärr och gränszonen skars ut. För att bestämma vävnadens dragelasticitet (Youngs modul) utsattes proverna för mekanisk testning i en Instron mekanisk universaltestare (Modell 3342, Instron) utrustad med serie IX/S−programvara med en korshuvudhastighet på 10 mm min-1.

histologi / immunhistokemi

diabilder av myokardvävnadssektioner framställdes från en delmängd av hjärtan som inte användes för mekaniska egenskaper Mätningar. Vid 28 dagar efter injektion skördades hjärtan, perfuserades med PBS, inbäddad i okt och snäppfryst i flytande kväve. Sektioner av 10 occurm skars med användning av en kryostat. För att bedöma ärrstorlek fixerades vävnadssektioner i 4% PFA under 1 h och färgades med Massons trichrome-procedur (Sigma). Bilder tagna med ett Olympus BX50-mikroskop med användning av ett 2-mål i mål och åtta sektioner per mus användes för att mäta väggtjocklek på distans och för att bestämma ärrstorlek med hjälp av miquant-bågmetoden med hjälp av miquant software66. För immunhistokemi fixerades vävnadssektioner i aceton under 20 min, permeabiliserades med 0,1% Triton under 10 min och blockerades sedan i 10% serum under 1 h vid rumstemperatur. Primära antikroppar applicerades över natten vid 4 C i 10% serum, och sedan sköljdes glidbanor och behandlades med sekundära antikroppar i 1 h vid rumstemperatur innan de monterades med fluorescerande monteringsmedium (Dako). För detektion av blodkärl och myofibroblaster, PECAM-1 (även känd som CD31; Santa Cruz 101454, 1: 50) och bisexuell-SMA (Abcam 5694, 1:200) antikroppar användes och detekterades med AF594 Anti-rat (Life Technologies a11008, 1:500) respektive AF488 Anti-rabbit (Life Technologies a11007, 1:500). M2-makrofager detekterades av AF488-konjugerad Anti-CD206-antikropp (Biolegend 141710, 1:50). För hjärt-troponin i-färgning inkuberades sektioner med AF488-märkt vetegroddaragglutinin (ThermoFisher, W11261) för 1 h vid 37 CCB följt av inkubation med Get-hjärt-troponin i-primär antikropp (Abcam ab56357, 1:200) och detekterades av donkey anti-goat AF594 sekundär antikropp (Life Technologies a-11058, 1:500). Slutligen inkuberades sektioner för connexin 43-färgning med connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) och hjärt-troponin I (Abcam ab188877, 1:200) primära antikroppar följt av detektion med AF488 anti-kanin (Life Technologies a11007, 1:500) respektive donkey Anti-goat AF594 sekundär antikropp (Life Technologies a-11058, 1:500). Fluorescerande bilder erhölls med användning av ett Zeiss Axio Observatörsmikroskop med ett mål för 20-objektivet och för connexin 43-färgade sektioner användes en Leica Aperio Versa-glidskanner med ett mål för 20-talet. För alla IHC-fläckar analyserades fyra sektioner per mus och för varje avsnitt 2-4 bilder inom gränszonen användes infarkt och avlägsna regioner för analys. För H&e-färgning fixerades vävnadssektioner i 10% formalin. Sektioner färgades sedan först i hematoxylin Gills lösning nr 2 i 7 minuter, följt av syraalkoholdifferentiering och sedan 0,5% eosin i 7 minuter, följt av uttorkning (alla lösningar från Sigma). Bilder togs med ett Olympus BX50-mikroskop. Gränszonen betecknades som FOV direkt intill vardera sidan av infarktregionen som börjar när 50% av LV är fibrotisk ärrvävnad (se kompletterande Fig. 11 för en schematisk bild).

cx3cr1-EGFP-musexperiment

för att utvärdera rekryteringen av cirkulerande mononukleära celler till myokardiet efter rHC-behandling köptes B6.129p-Cx3cr1 tm1litt/J-möss (Cx3cr1-EGFP) Från Jackson-laboratoriet. Dessa möss uttrycker förbättrat grönt fluorescerande protein i monocyter, dendritiska celler, NK-celler och hjärnmikroglia och är en modell som rapporterats för studien av mononukleär cellrekrytering till hjärtat67. Vid 1-veckors post-MI fick möss behandling av 50 occl av PBS, rHCI eller rHCIII, såsom beskrivits ovan. Djur dödades 2 dagar efter behandlingen och blod samlades in i EDTA-rör. Hjärtan perfuserades också med PBS och den högra ventrikeln och den apikala regionen i vänster ventrikel uppsamlades. Vävnaderna sköljdes med HBSS och smältes i 2.4U / ml dispas I (Roche) och 1 mg/ml kollagenas B (Roche) i 40 minuter vid 37 C. prover tvättades tre gånger med PBS, centrifugerades i 5 minuter vid 400 g och de isolerade cellerna bereddes för flödescytometri (FACS Aria III; Becton Dickinson). Celler märktes med APC anti-mus/human CD11b (Biolegend 101211), PE anti-mus Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-mus F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-mus CD38 (Biolegend 102717) och Alexa Fluor 200 anti-mus CD206 (Biolegend 141733), efter tillverkarens rekommenderade utspädningar (0.25 oC/l per 1 oc 106 celler för CD11b, Ly-6g/6C, CD38 och CD206 och 1 oc/L per 1 oc 106 celler för F4 / 80). Se Kompletterande Fig. 12 för sortering / gating strategi.

cellisolering och flödescytometri för monocytundergrupper

två dagar injektionsmöss efter behandling dödades genom CO2-inandning följt av cervikal dislokation. Blod samlades in från möss genom hjärtpunktur i en 50 mM EDTA-lösning, och RBC lyserades med lysbuffert för röda blodkroppar (RBC) enligt tillverkarens protokoll (Biolegend 420301). Celler isolerades från skördade mushjärtan med hjälp av en matsmältningsbuffert innehållande: DNAse i (50 U/ubyll; Sigma D5025), kollagenas typ II (400 U/mL; Termofisher 17101015), kollagenas D (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) och hyaluronidas (10 U/mL; Sigma H3506). Efter en timmes digestion vid 37 kg C passerade isolerade hjärtceller genom ett 70 kg filter. Till sist, skördade musspleens mosades och triturerades genom ett 70 oc-filter följt av inkubation med lysbuffert för röda blodkroppar (RBC). Cellpellets uppsamlades genom centrifugering vid 400g i 5 minuter vid 4 C. Isolerade celler från alla vävnader inkuberades med Zombie Aqua fixable viability dye (1: 500, Biolegend 423101) i 20 minuter vid rumstemperatur. Därefter blockerades Fc-receptorer med TruStain X-reagens (1:100, Biolegend 103319) i 10 minuter vid rumstemperatur. Cellerna inkuberades sedan med en antikroppscocktail i 45 minuter vid rumstemperatur innehållande CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17a2), B220-af488 (1:50, biolegend RA3-6B2), F480-Af647 (1:100, Biolegend BM8) och Ly6C-BV421 (1:80, BD Biosciences AL-21). Flödescytometri utfördes med användning av en BD FACS Aria III, och data analyserades med FlowJo V10.5. 2 programvara (se kompletterande Fig. 12 för sortering/gating strategi). Det totala livskraftiga cellnumret för varje vävnadspostisolering bestämdes genom trypanblå uteslutning med användning av en hemocytometer. Det totala antalet celler inom varje leukocytpopulation bestämdes med användning av procentandelen levande celler för en given cellpopulation och det totala antalet levande celler räknade efter isolering som sedan normaliserades till mg vävnad eller mL blod som samlats in. Grindstrategi: enstaka celler var gated baserat på FSC-A och FSC-H. levande enstaka celler var gated på låg färgning för Zombie Aqua live/dead dye. Från denna levande encellspopulation var leukocyter CD45+. Leukocytundergrupper karakteriserades enligt följande: neutrofiler CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C låga monocyter CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C höga monocyter CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, makrofager CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T−celler CD45+CD11b−Ly6G− CD3+B220−och B−celler CD45+cd11b−ly6g-CD3-B220+. Anmärkning För blood F480 uttryck användes inte i gating strategi. Gates sattes i förhållande till isotyp kontroller.

neonatala kardiomyocytstudier

neonatala råttventrikulära myocyter (Nrvm) isolerades nyligen med användning av ett etablerat protokoll68. Vänster ventrikel uppsamlad från 2 dagar gamla Sprague-Dawley–råttor (Harlan) smältes av trypsin (Amersham Biosciences) och kollagenas typ II (Worthington Biochemical). Isolerade celler suspenderades på nytt I m-199-mediet (Life Technologies) kompletterat med 10% FBS, 19,4 mM glukos, 2 mM L-glutamin, 2 U/mL penicillin, 0,8 kg/mL vitamin B12, 10 mM HEPES och 1 kg MEM icke-essentiella aminosyror (Sigma-Aldrich). Två omgångar av 60 min förplätering utfördes, under vilka hjärtfibroblaster fäster vid skålbotten, vilket berikar den icke-adherenta populationen för Nrvm. De icke-adherenta cellerna (Nrvm) såddes sedan på de olika kollagenmatriserna i 24-brunnsplattor (40 000 celler/cm2). För överlevnadsanalysen utsattes 3-dagars odlade Nrvm: er för M-199-media innehållande 50 kg väteperoxid i 3 timmar, varefter en Terminal Deoxynukleotidyltransferas dutp Nick-End-märkning (TUNEL) – analys utfördes och döda celler räknades i tre slumpmässiga synfält.

cellkulturer

med hjälp av ett etablerat protokoll isolerades benmärgs-härledda makrofager från 8-12 veckor gamla C57BL/6J mice69. Möss euthaniserades genom CO2-inandning och cervikal dislokation, och tibiaben samlades och spolades med media för att isolera benmärgen. Benmärgsisolatet pipetterades upprepade gånger för att erhålla en encellig suspension, som sedan passerade genom en cellsil. Nyligen isolerade celler odlades i 1 vecka i DMEM kompletterat med 10% FBS, 20% L929-konditionerade medier och penicillin–streptomycin och pläterades sedan på rHC-hydrogelerna i 3 dagar. Celler samlades in från rHC-hydrogeler med 3 mM CaCl2 Hanks buffertsaltlösning innehållande 250 enheter kollagenas I (Gibco). Makrofagpolarisering bedömdes med flödescytometri (FACS Aria III; Becton Dickinson) med användning av CD86 och CD206 (Biolegend) för att identifiera M1 respektive m2 makrofager. För mononukleär cellisolering uppsamlades benmärg från tibiaben som beskrivits ovan. Mononukleära celler renades genom densitetsgradientcentrifugering med användning av Histopaque Macau (Sigma) enligt tillverkarens instruktioner. Celler märktes med 0.5 occurg / ml DAPI (Sigma) i 30 min vid 37 occur C.

Makrofagadhesionsanalys

mononukleära celler isolerades genom att spola tibierna och lårbenen hos 6 – till 12 veckor gamla möss. Celler renades genom densitetsgradientcentrifugering med användning av Histopaque Bisexual (Sigma) enligt tillverkarens instruktioner. Mononukleära celler räknades och märktes med DAPI. Celler pläterades på de olika biomaterialen i en koncentration av 50 000 celler/cm2 under 24 timmar. celler fixerades med 4% PFA i 5 minuter och celler räknades. Uppgifterna uttrycktes i förhållande till kontrollen (icke-belagda brunnar, dvs., TCP) för att minimera effekten av Inter-donatorcellvariabilitet.

makrofagmigrationsanalys

Benmärgsmononukleära celler odlades i DMEM kompletterat med 10% FBS, 20% L929-konditionerat medium och penna/Strep i 7 dagar för att generera benmärgs-härledda makrofager (BMDMs) och märkta med DAPI, såsom beskrivits ovan. Bmdm: er (2 105 kcal) suspenderades sedan på nytt i EBM som saknade tillväxtfaktorer och serum och laddades in i den övre kammaren på en Transwell-platta (Life Technologies) belagd med 100 kcal rHCI eller rHCIII. Den nedre kammaren innehöll fullt makrofagmedium som beskrivits ovan. Efter 24 h avlägsnades insatserna och antalet Bmdm som migrerade genom biomaterialet kvantifierades på ett blindat sätt med hjälp av ett Zeiss Z1-fluorescensmikroskop. Data uttrycktes i förhållande till kontrollen (icke-belagda brunnar, dvs TCP) för att minimera effekten av Inter-donatorcellvariabilitet.

Makrofagpolariseringsanalys

BMDMs genererades i DMEM kompletterat med 10% FBS, 20% L929-konditionerat medium och penna/Strep i 7 dagar, såsom beskrivits ovan. För makrofagaktiveringsexperiment stimulerades celler i 3 dagar med lipopolysackarid (1 msk/ml; Sigma) plus IFN-60 (50 ng/ml; Sigma) för M1-aktivering eller med IL-4 (20 ng/ml; r&d-system) för M2-aktivering. Det totala RNA extraherades med användning av Tri-reagens (Zymo-forskning), enligt tillverkarens protokoll. Första strängen cDNA syntetiserades med Smartscribe omvänd transkriptas (Takara Bio USA) och slumpmässiga hexamerprimrar (Fisher Scientific). Målgen-mRNA-nivåer bedömdes med kvantitativ RT-PCR med LightCycler 480 SYBR Green i Mastermix (Roche) och ett LightCycler 480 realtids-PCR-System (Roche). Sekvenser för primerpar listas i kompletterande Tabell 2. Relativa förändringar i mRNA-uttryck bestämdes med hjälp av ct-metoden för ct, uttryckt som nivåer i förhållande till 18S. data uttrycktes i förhållande till kontrollen (icke-belagda brunnar, dvs TCP) för att minimera effekten av Inter-donatorcellvariabilitet.

överlevnad efter H2O2-exponering

celler odlades i 7 dagar i DMEM kompletterat med 10% FBS, 20% L929-konditionerat medium och penna/Strep. På dag 7 ändrades mediet till DMEM innehållande 0,5 mM väteperoxid och celler odlades i 3 timmar innan de färgades med 7-AAD för analys med flödescytometri. Data uttrycktes i förhållande till kontrollen (icke-belagda brunnar, dvs TCP) för att minimera effekten av Inter-donatorcellvariabilitet.

statistisk analys

statistisk analys utfördes med användning av Kaleida Graf 4,5 kcal. Alla data presenteras som medelvärdet av sem för sem. För jämförelse av in vivo-data mellan behandlingar användes en ANOVA följt av Holms korrigering för multipla jämförelser. Ärrstorlek analyserades med användning av en multipel regression, inklusive behandlingsgrupp (rHCI, rHCIII och PBS) och baslinje LVEF. rHCI och rHCIII jämfört med PBS var signifikanta prediktorer för infarktstorlek, utöver baslinjen LVEF. Korrelationskoefficienten för modellen är 0,6 med användning av STATA multipel linjär regression. In vitro nrvm, makrofag och hjärtfibroblastdata analyserades antingen genom en Students t-test eller genom en enkelriktad ANOVA med en Holms korrigering för flera jämförelser, som anges i figuren legender.

rapportsammanfattning

ytterligare information om forskningsdesign finns i sammanfattningen Nature Research Reporting som är kopplad till denna artikel.