Kloramfenikolacetyltransferas som en urvalsmarkör för chlamydial transformation
pGFP::SW2, shuttle vector konstruerad av Wang et al, innehöll en hCG-laktamasgen som en urvalsmarkör. Det bär också en KATTGEN som är smält till GFP-genen . Vi fann att E. coli transformerad med pgfp:: SW2 plasmid kunde växa i medium innehållande kloramfenikol (slutlig koncentration: 170 USC / ml), vilket tyder på att CAT-genen också kan användas som en urvalsmarkör för chlamydialtransformationsexperiment. Som varnade av Wang et al., en negativ effekt av kloramfenikol på värd mitokondrier, vilket demonstreras av Li et al. kan påverka nyttan av detta antibiotikum för chlamydial transformation . I Li et al.i sin rapport var den minimala toxiska koncentrationen av kloramfenikol 10 kg / ml, vilket orsakade en mild 20% minskning av ATP-produktionen. Vi har bestämt att den uppenbara lägsta kloramfenikolkoncentrationen som fullständigt inhiberade inkluderingsbildning i plasmidfri C. trachomatis L2-stam betecknad L2R var endast 0,05 Kg/ml (data visas inte), vilket var långt under koncentrationerna giftiga för värdceller. Därför resonerade vi att detta antibiotikum kunde användas för att välja KATTUTTRYCKANDE transformanter utan att väsentligt betona värdceller.
vi transformerade L2R med pGFP::SW2 och valde hälften av de transformerade cellerna med ampicillin och den andra hälften med kloramfenikol. Antibiotika (2 kg/ml ampicillin eller 0,1 kg/ml kloramfenikol) tillsattes till kulturerna vid 10 timmar efter transformation. Från och med passage 2 ökades deras koncentrationer till 5 respektive 0,2 kg/ml, och de tillsattes vid tidpunkten för ympningen. Delningsförhållandet mellan passager förblev 1: 1 från passage 1 men passage 4. Även om mic av kloramfenikol, som bestämdes vid låg multiplicitet av infektion (~0,1 inklusionsbildande enheter per cell), var 0,05 occurg/ml, förväntades några av de otransformerade chlamydiae bilda inklusioner i närvaro av 0,1 – 0.2 kg/ml antibiotikumet, eftersom vi använde ett högt EB till cellförhållande för transformation, och effekten av klamydial tillväxthämning av antibiotika påverkas av infektionens mångfald . Med det ovan beskrivna urvalsprotokollet, i kulturer valda med ampicillin, under ett faskontrastmikroskop, befanns nästan 100% celler innehålla en inkludering med avvikande RBs vid den initiala passagen. De avvikande RB-innehållande inneslutningarna var fortfarande närvarande i en liten andel celler vid passage 2, men ersattes mestadels av uppenbarligen normala inneslutningar vid passage 3. Normala inneslutningar hittades i cirka 20% celler, och onormala inneslutningar observerades sällan vid passage 4. Vid passage 5, som resulterade från inokulering med 10% skörd från passage 4, hittades inneslutningar i 80% celler; uppenbarligen innehöll ingen av dessa inneslutningar avvikande RBs.
eftersom kloramfenikol inte orsakar chlamydiae att bilda avvikande RBs, bedömde vi resistens mot antibiotikumet genom inklusionsstorleken. Inneslutningar av mindre än normala storlekar detekterades i nästan alla celler vid passage 1. Några, men mycket små, inneslutningar hittades vid passage 2, och de flesta av dessa inneslutningar ersattes med normalstora inneslutningar genom passage 3. Normalstora inneslutningar hittades i mer än 20% celler vid passage 4. Vid passage 5, härledd efter inokulering med 10% passage 4 skörd, och en ökning av kloramfenikolkoncentrationen (från 0,2 kg/ml till 0,5 kg/ml), hittades normala inneslutningar i nästan 100% celler 0000000.
förutom uppenbar resistens mot selektionsmedlen använde vi GFP-uttryck och återställande av glykogensyntes som ytterligare markörer för framgångsrik transformation . EBS skördade från passage 5 användes för att infektera McCoy-celler vid en utspädningshastighet på 1:100 (cellnummerekvivalens) för experiment som bestämmer GFP-uttryck och glykogensyntes (Figur 2). Som förväntat uttryckte varken vildtypsplasmidfylld C. trachomatis L2 (434/bu) (figur 2a) eller oförvandlad plasmidfri L2R (Figur 2B) GFP. Överensstämmer med etablerade fynd som glykogensyntes i C. trachomatis kräver sin plasmid, jodfläck visade att glykogen ackumulerades i inklusionerna av vildtyp L2 (figur 2a) men inte de av L2R (Figur 2B). I närvaro av 5 kg / ml ampicillin, som hämmar RB division, icke-transformerade L2R (figur 2C) bildade inneslutningar innehållande jätte RBs utan att producera glykogen; medan kloramfenikol (slutlig koncentration: 0,5 kg/ml) helt inhiberade bildandet av synliga inneslutningar i L2R infekterade-celler (figur 2D). Överensstämmer med data publicerade av Wang et al. , pGFP::SW2-transformerad L2R vald med ampicillinformad GFP-positiva inklusioner med glykogen (figur 2e). PGFP:: SW2-transformerad L2R vald med kloramfenikol bildade också GFP-positiva inklusioner innehållande glykogen (figur 2F). Som förväntat kunde ampicillinvalda transformanter bilda normalstora, GFP-positiva, glykogeninnehållande inneslutningar i närvaro av kloramfenikol (figur 2G); på samma sätt var kloramfenikolvalda transformanter helt resistenta mot ampicillin, uttryckte GFP och producerade glykogen (figur 2h). Dessa resultat tyder på att KATTGENEN i pGFP::SW2-plasmid är funktionellt i chlamydiae, och kloramfenikolresistens kan användas som en urvalsmarkör för chlamydial transformation.
inklusion, GFP-uttryck och glykogensyntes av pGFP::SW2-transformanter av C . trachomatis L2. Ej transformerad plasmidfylld stam 434 / bu (a), ej transformerad plasmidfri stam L2R (B-D) och transformerad L2R vald med antingen ampicillin (E, G) eller kloramfenikol (F, H) odlades antingen med medium innehållande ett indikerat antibiotikum eller med antibiotikafritt medium. Bilder av inneslutningar i ofärgade och jodfärgade kulturer förvärvades med faskontrastmikroskopi eller fluorescensmikroskopi 48 h efter inokulering. I alla paneler är faskontrast och GFP-bilder överlägsna.
Därefter tog vi bort genen för laktamas från pgfp::SW2-plasmid som beskrivs i avsnittet” metoder ” och använde den resulterande pGFP-CAT::SW2-plasmid för att transformera L2R. transformerade chlamydiae utsattes för selektion med kloramfenikol med samma regim som beskrivits ovan. Kloramfenikolresistenta inneslutningar uppstod i cirka 20% av de infekterade cellerna i kulturen för passage 4. Fluorescensmikroskopi och jodfläck avslöjade GFP-och glykogenpositiva inneslutningar i celler som infekterades med EBs skördade från passage 5 och odlades i närvaro av kloramfenikol (Figur 3, övre panelen). Men som ett resultat av brist på pgfp-CAT::SW2 plasmid av pgfp-laktamas, kunde transformatorerna inte bilda normala inneslutningar i närvaro av ampicillin; istället fylldes deras inneslutningar med avvikande RBs. Medan de oregelbundna inklusionerna fortfarande var positiva för GFP var de i stort sett fria från glykogen (Figur 3, nedre panelen). Efter passage 5 odlades pgfp-CAT::SW2-transformanterna med 0,5 kg/ml kloramfenikol för ytterligare fyra passager vid ett 1: 100-delningsförhållande för varje passage. Alla inneslutningar vid passage 9 hade samma utseende som inneslutningarna av plasmid-fylld klamydia och inte den för den plasmidfria L2R, och alla befanns uttrycka GFP (data visas inte). Dessa resultat bevisar att CAT-genen i pgfp-CAT::SW2-plasmid, liknande pgfp::SW2-plasmid, fungerar som en urvalsmarkör för C. trachomatis-transformation.
inklusion, GFP-uttryck och glykogensyntes i L2R transformerad med pGFP-CAT::SW2. Celler infekterade med kloramfenikol-utvalda transformanter exponerades för antingen kloramfenikol eller ampicillin. Bilder av inneslutningar i ofärgade och jodfärgade kulturer förvärvades med faskontrastmikroskopi eller fluorescensmikroskopi 48 h efter inokulering. Faskontrast och GFP-bilder är överlägsna.
det bör noteras att Tam et al. har tidigare försökt utveckla ett transformationssystem med CAT-genen som en selektiv markör . I den studien elektroporerades en skyttelvektor innehållande en KATTGEN till EBs av C. trachomatis E (stam UW-5/CX) och L2 (stam 434/Bu). Även om både katt-mRNA och enzymaktivitet var detekterbara i de initiala kulturerna av transformerade chlamydiae, misslyckades författarna att erhålla stabila transformanter efter urval med kloramfenikol för 4 passager. Det är viktigt att notera att båda stammarna elektroporerade innehåller en nativ plasmid som delar samma replikeringsursprung med den rekombinanta plasmid som används för transformation . Sedan Wang et al. kunde endast erhålla stabila penicillinresistenta transformanter från L2R, en plasmidfri C. trachomatis L2 variant, men inte den vilda typen, plasmid-fylld 434/Bu , under annars identiska experimentella Inställningar, det är retroaktivt inte förvånande att Tam et al. det gick inte att härleda stabila kloramfenikolresistenta klamydier.
