kollagensyntes

reglering av Benkollagensyntes

kollagensyntes i organkulturer av gnagare calvariae och cellkulturer har bedömts med flera olika analyser . I den mest använda analysen inkuberas calvariae och celler med radioaktivt märkt prolin i flera timmar före slutet av kulturen. Införlivandet av radioaktivt märkt prolin i kollagenas-smältbart protein (CDP-märkning) och icke-kollagenprotein (NCP-märkning) mäts i extrakt av kulturerna med högrenat bakteriellt kollagenas . Den procentuella kollagensyntesen beräknas från CDP-och NCP-värdena efter korrigering för större överflöd av prolin i kollagen i förhållande till icke-kollagenproteiner . Kollagenproduktion kan också bestämmas genom att mäta hydroxiprolininnehållet i cell-eller organkulturer, eftersom hydroxiprolin är praktiskt taget unikt för kollagener. Dessa metoder skiljer inte mellan olika typer av fibrillärt kollagen. Emellertid är kollagenet syntetiserat av benorgankulturer och de flesta osteoblastiska cellkulturer till stor del typ i (>95%) så att CDP-märkningsvärdet vanligtvis återspeglar typ i-kollagensyntes. Om så önskas kan produktionen av olika kollagentyper särskiljas genom jonbytarkromatografi och polyakrylamidgelelektrofores av radiomärkta extrakt av cell-eller organkulturer . Kollagenuttryck av typ i i humana cellkulturer har också bedömts genom mätning av utsöndring av prokollagen i C-terminal propeptid . Slutligen har specifika cDNA-sonder i norra blotting och allelspecifika primers i omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktionsanalyser använts för att bedöma kollagen mRNA-uttryck i benmodeller. Mätningen av effekten av 1,25(OH)2D3 på kollagensyntes och mRNA-nivåer har gett jämförbara resultat med hjälp av dessa olika analyser.

1,25(OH)2D3 hämmar kollagensyntes i organkulturer av 21-dagars fetal råtta calvariae och neonatal mus calvariae med liten eller ingen effekt på icke-kollagenproteinsyntes. Maximal hämning av kollagensyntes med 1,25 (OH)2D3 i råttkalvarier (cirka 50%) uppträder vid 10 nM . 1,24 R, 25 – (OH)3D3 hämmar också kollagensyntes men är mindre potent än 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 och 24R,25(OH) 2D3 förändrar inte kollagensyntesen under 100 nM . D-vitaminmetaboliter hämmar kollagensyntes och stimulerar resorption av fetala råttlånga ben med liknande relativa förmågor som korrelerar med affiniteten hos metaboliterna för skelett-VDR . För att bestämma cellselektiviteten hos 1,25(OH)2D3-inhiberingen av kollagensyntes behandlades organkulturer av fetala råttkalvarier med 1,25 (OH)2D3 för 22 h och inkuberades sedan med tritierad prolin för den slutliga 2 h-kulturen. Det centrala benet (mogna osteoblaster) dissekerades fritt från periosteum (mindre mogna osteoprogenatorer och fibroblaster) och båda facken analyserades separat för införlivandet av tritierad prolin. 1,25 (OH)2D3 minskar kollagensyntesen i det centrala benet men inte periosteum, vilket indikerar selektivitet för 1,25(OH) 2D3-effekten för mogna osteoblaster . Med hjälp av ett in vivo-protokoll där neonatala råttor fick flera injektioner av tritierad prolin till radiomärkning av nysyntetiserad benmatris, hämmade 25 ng av 1,25(OH)2D3 som gavs på dag 1, 3 och 5 benmatrissyntes som bedömdes genom histomorfometri av autoradiografer av tibia och calvariae .

1,25 (OH)2D3 hämmar också kollagenproduktionen i råtta osteoblastisk osteosarkom ROS 17 / 2.8-celler , primära råtta och mus osteoblastiska celler och en odödlig Murin osteoblastcellinje (MMB-1). 1,25 (OH) 2D3 har en större hämmande effekt på kollagensyntes av typ i under loggfastillväxt av primära murina osteoblastiska celler än vid sammanflöde, kanske för att prolifererande celler innehöll mer VDR . På samma sätt är 1,25 (OH)2D3-hämning av kollagensyntes större i glesa kulturer av MMB-1-celler som har högre VDR-nivåer än sammanflytande MMB-1-celler . 1,25 (OH)2D3 hämning av kollagensyntes är ekvivalent i glesa och sammanflytande råttprimärkostoblastiska celler , men VDR-nummer förändrades inte under tillväxten av cellerna . Sammantaget visar dessa data att graden av inhibering av kollagensyntes med 1,25(OH)2D3 bestäms till stor del av den cellulära kvantiteten VDR. 1,25 (OH) 2D3 hämmar kollagen-mRNA-nivåer under den proliferativa fasen av långsiktiga kulturer av rått primära osteoblastiska celler och förhindrar bildandet av mineraliserade benknutor genom dessa kulturer . Dessa studier visar att 1,25 (OH)2D3 hämmar differentieringen av osteoprogenitorer som bildar mineraliserade knölar i primära osteoblastiska cellkulturer . Inhiberingen av nodulbildning med 1,25(OH)2D3 kan emellertid vara sekundär till undertryckandet av typ i-kollagensyntes i kulturerna.

i motsats till de hämmande effekterna som beskrivs ovan stimulerar 1,25(OH)2D3 övergående kollagen och icke-kollagenproteinsyntes (ungefär dubbelt), som toppar mellan 12 och 24 h, i den odödliga murina osteoblastiska cellinjen MC3T3-E1 . I denna studie rapporterades inte procent kollagen syntetiserat av kulturerna (kollagen i förhållande till total proteinsyntes) ; som ett resultat var det inte möjligt att bestämma selektiviteten hos 1,25(OH)2D3-effekten för kollagensyntes. 1,25 (OH) 2D3 ökar också kollagenuttrycket i den humana osteoblastiska osteosarkom-cellinjen MG-63 och primära kulturer av humana osteoblastiska celler . Intressant är att ökningen av kollagensyntes med 1,25(OH)2D3 i mg63-celler blockeras av insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 5, som interagerar direkt med VDR och förhindrar heterodimerisering med retinoid X-receptorn RXR . I andra studier har emellertid 1,25(OH)2D3 visat sig minska procentuell kollagensyntes i MC3T3-E1-celler . MC3T3 – E1 och MG-63 representerar preosteoblastiska celler som genomgår in vitro osteogen differentiering med askorbinsyra; 1,25(OH)2D3 hämmar celltillväxt och ökar osteokalcinuttryck och alkalisk fosfatasaktivitet i båda cellinjerna. MC3T3E1-celler, som de flesta odödliga osteoblastiska cellinjer, visar signifikant fenotypisk variation . Därför kan vissa av dessa avvikande resultat bero på variationer i cellerna som används för experimenten. Sammantaget tyder dessa data på att 1,25(OH)2D3 kan fungera som ett differentierande hormon i tidiga celler i osteoblastlinjen, vilket resulterar i ökat kollagenuttryck av typ I. Däremot hämmar 1,25 (OH)2D3 typ i-kollagenuttryck i mogna osteoblaster.